大肠杆菌高密度发酵
基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究
基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究摘要：基因工程技术在现代生物学研究中扮演着重要角色，其中重组大肠杆菌的高密度发酵是生产重组蛋白的关键步骤之一。
本研究旨在优化基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4的高密度发酵过程，从而提高目标蛋白的产量和纯度。
通过优化分析发酵条件、培养基组成以及流程设计，实现了对目标蛋白高效表达的优化。
引言：口蹄疫是一种传染性疾病，严重威胁到了畜牧业的健康发展。
基因工程技术提供了一种制备和表达相关病毒蛋白的方法，为疫苗研发和疫病防控提供了有力支持。
本研究以口蹄疫病毒血清型B4为目标蛋白，通过利用基因工程重组大肠杆菌BL21系统来高效表达和纯化目标蛋白，从而为口蹄疫疫苗的研究和生产奠定基础。
材料与方法：1. 介绍BL21-FMDV-B4菌株的构建及质粒的转化；2. 优化培养基配方和条件：通过改变碳源、氮源、金属盐和抗生素浓度等因素来寻找最佳表达条件；3. 优化发酵过程：调整发酵时间、发酵温度以及pH值等因素来提高目标蛋白的表达水平；4. 实时监测目标蛋白的表达量和纯度：采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白质分析。
结果与讨论：经过优化后，我们成功获得高密度表达口蹄疫血清型B4的重组大肠杆菌BL21菌株。
最佳培养基组成为：碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸出物，抗生素为氨苄青霉素。
在最佳培养条件下，重组菌株BL21-FMDV-B4在37℃下发酵12小时，初始pH设定为7.0。
通过实时监测发酵过程中菌体密度、发酵液酸度和宏观形态等指标，得到了最佳发酵时间和条件。
经过优化后的发酵过程，我们的研究结果发现，相比于常规条件，目标蛋白的表达量和纯度显著提高。
通过SDS-PAGE和Western blotting分析，我们证实目标蛋白在重组大肠杆菌中得到成功表达和高效纯化。
结论：通过针对基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究，本研究成功提高了目标蛋白的产量和纯度。
猪致病性大肠杆菌高密度发酵条件优化的研究的开题报告
猪致病性大肠杆菌高密度发酵条件优化的研究的开
题报告
猪致病性大肠杆菌是一种常见的细菌性病原体，可能引起猪群的腹泻、呕吐以及其他消化系统疾病。
在猪肉业中，这种病菌会严重影响养
猪效益，因此针对其高效防治是关键的技术研究方向。
发酵技术是一种生产高效的细菌量的重要手段，但是对猪致病性大
肠杆菌发酵过程的研究还需要进一步深入。
因此，本文旨在探究猪致病
性大肠杆菌高密度发酵条件的优化研究。
本文的研究内容包括：（1）采样筛选猪致病性大肠杆菌的优良菌株，（2）建立适宜猪致病性大肠杆菌高密度发酵的培养基成分以及培养条件，（3）研究不同发酵条件下的猪致病性大肠杆菌生长动力学及细菌数量变化规律，（4）分析猪致病性大肠杆菌发酵产物的主要营养成分及微生物安全性。
通过实验，我们将逐步探究不同培养条件对于猪致病性大肠杆菌高
密度生长的影响，家禽饲料、动物血浆以及葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等
添加物作为基础培养成分，运用响应面试验方法，进行优化研究。
同时，我们将使用红外光谱分析法以及菌落计数法、凝胶过滤法等分别对发酵
产物进行分析，最终确定一种针对猪致病性大肠杆菌高密度发酵的优化
发酵工艺。
本文研究成果不仅对猪肉业的可持续发展提供了技术支持，对于研
究动物肠道菌群 also 有重要的借鉴价值。
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。
方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。
结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。
结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
标签：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation，HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。
但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。
蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。
因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。
关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表达的影响，国内目前的相关研究报道偏少。
国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。
在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的工业微生物，具有广泛的应用价值。
在大肠杆菌高密度发酵过程中，流程的设计和优化对产品的质量和产量具有重要影响。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，探讨其流程设计、优化及相关技术。
通过对该工艺流程的深入研究，不仅可以提高重组蛋白的产量和纯度，还可以降低生产成本，为工业生产提供可靠的技术支持。
一、高密度发酵工艺流程概述1.1 菌种培养和预处理重组大肠杆菌菌种的培养是整个发酵过程的基础。
首先需要进行菌种的接种培养，培养基的选择、发酵条件的控制对于菌种的生长和繁殖至关重要。
对菌种的预处理也至关重要，包括对菌种进行筛选和培养基的调整等。
1.2 发酵过程控制发酵过程控制是重组大肠杆菌高密度发酵的关键环节，包括培养基的添加、通气量的控制、温度、pH值的调节等。
合理的发酵过程控制可以保证菌体的生长和代谢活性，从而提高产物的产量和纯度。
1.3 产物的回收和纯化重组大肠杆菌高密度发酵后，产物的回收和纯化也是至关重要的环节。
通过合理的回收和纯化工艺，可以获得高纯度的重组蛋白产品，满足不同应用领域的需求。
二、高密度发酵工艺流程优化2.1 发酵条件的优化在重组大肠杆菌高密度发酵过程中，发酵条件的优化对产品的产量和质量具有重要影响。
包括但不限于培养基配方的优化、发酵温度、通气量、pH值等参数的优化，通过优化发酵条件可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
2.2 发酵过程监测与控制发酵过程的监测与控制是优化工艺流程的重要手段，包括对菌体生长情况的实时监测、代谢产物浓度的检测以及对发酵过程参数的实时调节等。
通过发酵过程的精准监测和控制，可以最大程度地发挥菌体的生长和代谢潜力。
2.3 产物回收与纯化工艺的改进产物的回收与纯化是影响产品质量的关键因素，通过改进产物回收与纯化工艺，可以提高产品的纯度和收率，降低生产成本，提高经济效益。
三、高密度发酵工艺流程相关技术3.1 培养基配方优化技术合理的培养基配方对于重组大肠杆菌的生长和表达具有重要影响，通过优化培养基配方，可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程重组大肠杆菌是一种常用的工具菌株，被广泛应用于生物工程领域。
高密度发酵是指在发酵过程中，通过优化工艺条件，使菌体达到较高的生长速率和产物产量。
本文将介绍重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程。
一、菌种培养重组大肠杆菌菌种的培养是高密度发酵的第一步。
首先，选择合适的菌种，通常是具有高表达能力的重组菌株。
然后，将菌种接种到培养基中，并在适当的条件下培养。
培养基的组成要根据菌株的特性进行优化，以促进菌体的生长和表达目标蛋白的产量。
二、发酵过程控制高密度发酵的关键是精确控制发酵过程中的各个参数，以最大限度地提高菌体的生长速率和产物产量。
常见的控制参数包括温度、pH 值、溶解氧浓度和搅拌速度等。
1.温度控制：重组大肠杆菌的适宜生长温度通常在37℃左右。
在发酵过程中，保持恒定的温度可以促进菌体的生长和产物的积累。
2.pH值控制：重组大肠杆菌对pH值的敏感性较高，通常在发酵过程中需要控制pH值在6-7之间。
可以通过添加缓冲剂来维持合适的pH值。
3.溶解氧浓度控制：溶解氧浓度是影响菌体生长的重要因素之一。
通过调节搅拌速度和通气量等参数，可以控制发酵过程中的溶解氧浓度，从而提高菌体的生长速率。
4.搅拌速度控制：适当的搅拌速度可以提供充分的氧气和营养物质，促进菌体的生长和产物的积累。
但过高的搅拌速度可能会导致剪切力过大，对菌体造成伤害。
三、营养物质的供应在高密度发酵过程中，菌体需要大量的营养物质来支持生长和产物的合成。
常见的营养物质包括碳源、氮源、磷源和微量元素等。
在发酵过程中，需要根据菌株的特性和产物的需求，合理调整营养物质的浓度和比例。
四、产物的回收和纯化高密度发酵得到的产物通常以细胞外分泌形式存在，因此需要对发酵液进行回收和纯化。
常用的方法包括离心、过滤、超滤和层析等技术。
通过这些步骤，可以将目标产物从发酵液中分离出来，并得到较高纯度的产物。
总结起来，重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程包括菌种培养、发酵过程控制、营养物质的供应和产物的回收和纯化等步骤。
表羰基还原酶的大肠杆菌高密度发酵的培养基优化设计
表羰基还原酶的大肠杆菌高密度发酵的培养基优化设计表羰基还原酶是一种重要的酶类，能够催化醛或酮化合物的还原反应。
大肠杆菌是常用的表羰基还原酶生产菌株之一。
在高密度发酵过程中，培养基的优化设计对于提高表羰基还原酶产量至关重要。
培养基的优化设计包括以下几个方面：基础培养基成分的选择、碳源和氮源的调节、微量元素和辅助因子的添加、pH和温度的控制以及培养条件的优化等。
首先，基础培养基成分的选择是培养基优化的基础。
常用的基础培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和缓冲剂等。
在设计培养基时，需要考虑到大肠杆菌对碳源和氮源的需求，选择适宜的成分进行配比。
其次，碳源和氮源的调节对于表羰基还原酶产量的调控至关重要。
碳源的选择应考虑其对大肠杆菌生长和表羰基还原酶产量的影响。
常用的碳源包括葡萄糖、甘油等。
氮源的选择也要考虑其对表羰基还原酶产量的影响，常用的氮源包括酵母提取物、胰蛋白胨等。
此外，微量元素和辅助因子的添加对于培养基的优化也是十分重要的。
微量元素如铁、锌、铜等能够促进表羰基还原酶的合成和活性，辅助因子如维生素等能够提高大肠杆菌的生长和代谢能力。
调控培养基的pH和温度也是重要的因素。
pH的控制可以通过添加缓冲剂来实现，一般大肠杆菌的生长适宜的pH范围为6.5-7.5。
温度的控制需要根据大肠杆菌的生长特性和表羰基还原酶的最适工作温度来确定。
最后，优化培养条件也是提高表羰基还原酶产量的关键。
包括摇床转速、氧气供应、培养时间等因素的调控，以及对产酶菌株的预处理等。
通过以上的培养基优化设计，可以提高大肠杆菌表羰基还原酶的产量，并为进一步应用提供了可靠的基础。
大肠杆菌高密度发酵研究
的目的。
万方数据
２８
Ａｎｉｍａｌ
ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ耻Ｖ０１．１８
Ｎｏ．１（Ｔｏｔａｌ№．７３）
菌ｗｓＨ—ＫＥ发酵２４ ｈ，细胞干重达最大，细胞内 ＧｓＨ含量也高于其它糖浓度ｏ］。对高密度发酵大肠 杆菌生产重组人骨形成蛋白一２Ａ的研究也表明：基质 中初糖浓度为１０ ｇ／Ｌ时细胞浓度和产物表达量均获 得了较好的效果”］。上述研究表明：当培养基中糖初 始浓度为１０ ｇ／Ｌ时，可获得理想的发酵效果。如果培 养基中糖浓度过高，超过菌体生长需要量，则会导致 乙酸生成。糖浓度超过５０ ｇ／Ｌ时大肠杆菌的生长将 受到抑制…。以甘油代替葡萄糖作为碳源则可减少代 谢剐产物——乙酸的积累，而且更易达到重组苗的高 密度和外源蛋白的表达［５］。 除碳源外．培养基中的氮源、微量元素和各种无 机盐含量对大肠杆菌发酵也有较大影响。一般而言， 大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖（５０ ｇ／ Ｌ）、氟（３ ｇ／Ｌ）、Ｆｅ２＋（１．１５ ｇ／Ｌ）、Ｍ９２＋（８．７ ｇ／Ｌ）、
●幸文■
１ Ｌｅｅ．Ｓ Ｙ
对于重组大肠杆菌，要达到重组产物的最大产 率，还要考虑合适的诱导时问和诱导强度。一般在对 敷生长中期进行升温诱导表达。在利用温度诱导型的 重组质粒生成ＢＭＰ一２Ａ时，细菌对数中期诱导比后 期诱导产率提高３２％“】。另外，在生产中，由于发酵 液中含大量蛋白质、多糖等物质。因此，搅拌时会产生 大量气泡。如果泡沫持续过久，除了会降低发酵罐的 有效容积外，还会防碍菌体呼吸，造成代谢异常而使 菌体早期自溶。对此。在生产中，要适当减轻搅拌尉烈 程度，同时少加或缓加一些易起泡原料；要用天然油 脂和合成消沫荆等消除已生成的泡沫。 ２发肆方式选择 补料分批发酵是近几年兴起的一项新技术，已被 广泛地应用于各种微生物的高密度发酵。它是指在微 生物分批发酵中以某种方式连续补加一定物料的培 养技术，主要包括非反馈补料和反馈补料两种类型。 前者包括恒速补料、变速朴料和指数补料三种方法｝ 后者包括恒ｐＨ值法、恒溶氧法、菌体浓度反馈法、 ｃＥＲ法和ＤＯ—ｓｔａｔ法。由于流加方式的不同，它们对 菌体生长及外潦蛋白表达的影响也不同。因指效流加 法比较简单，不需复杂设备，采用这一方法培养大肠 杆菌可将细胞比生长率控制在不产生副产物（如乙 酸）范围之内，所以颇受重视。该技术已广泛用于重组 大肠杆菌高密度培养生产外源蛋白。另外，它还可作 为独特动力学研究手段代替连续培养来考查培养过 程中的重要动力学参数特性。研究发现指数流加不仅 在提高菌体密度、生产强度和产物表达总量方面有显 著的优势，而且实际过程的比生产速率平均值与设定 值非常接近”］。 ３发酵终点爿断及异常发酵处理 ３．１发酵垮点判断 发酵终点的判断对提高菌体和外源蛋白的产量 及质量，以及缩短生产周期是很重要的。发酵初期，菌 体数量增加较快。但到了后期，大部分细菌已停止生 长，甚至死亡．此时，若继续发酵，则既浪费时间和财 力，又影响产物质量。溶氧规律性变化反映了大肠杆 菌生长的规律，因此将溶氧作为终止发酵的信号。在 发酵初期，由于茵体密度急剧增加．耗氧量较大，溶氧 曲线迅速下降。在对救生长期降到最低｝随后进入细
大肠杆菌高细胞密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：郑帅超学号：201106040030专业班级：11 生物技术指导教师：李安华2014年5月26日课程设计任务书设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班11生物技术设计要求：1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的帮助下完成题目设计。
2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。
3、学生在实验室完成实验方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
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课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：******学号：************专业班级：10生物工程（2）班指导教师：*****课程设计任务书大肠杆菌的高密度摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。
针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。
我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值目录1.设计背景 (1)1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)1.2高密度发酵定义 (1)1.3 规定标准 (1)2.设计方案 (2)3.方案实施 (3)3.1 大肠杆菌简介 (3)3.2 菌种选材 (3)3.3 种子扩大培养 (3)3.4 发酵培养基配比 (3)3.5 发酵过程 (4)4.结果与结论 (7)5.收获与致谢 (9)6.参考文献 (10)1.设计背景1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。
人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。
在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。
1.3 规定标准我国质量标准规定，根据大肠杆菌的高密度发酵，发酵罐中生物量达到150—200g/l。
根据这一标准，制定出整个试验生产计划。
微生物的发酵方式主要有分批、连续和补料分批3种。
在本次大肠杆菌发酵中，我们采用补料分批培养。
分批补料发酵定义：补料分批发酵以分批发酵为基础，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种发酵技术。
在分批发酵培养开始，投入较低的浓度底物，当微生物开始消耗底物后，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中放出培养液的一种发酵方式。
这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。
使微生物处于最佳的生长环境。
这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
在此过程中，我们使用50L发酵罐采用分批补料方式对大肠杆菌进行培养。
实时监测培养过程中的溶氧，PH以及温度等发酵参数，每隔两小时取料测定料液OD值，氨基氮，还原糖等数据。
直至大肠杆菌停止生长。
3.1 大肠杆菌简介在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。
正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。
大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。
其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。
周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。
其代谢类型是异养兼性厌氧型。
3.2 菌种选材实验室保存大肠杆菌菌种3.3 种子扩大培养培养基：LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，PH7.0液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 的无菌种子培养基的液体试管中，摇匀，置于37℃培养箱24h。
三角瓶扩大培养：将上述培养好的液体试管种子接种入250ml含有灭过菌的100ml 培养基的三角瓶中，37℃培养箱中18h。
摇瓶培养：按照1%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min振荡培养3.4 发酵培养基配比培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO4 4、K2HPO4 18、MgS04 1.2（单独灭菌），微量元素液1mL。
流加培养基I(g/L)：葡萄糖600,7水硫酸镁10。
ph调节剂：0.5mol/L氨水3.5 发酵过程将已调配好的新鲜培养基注入发酵罐中，设定温度121℃，时间25 min，对发酵罐，培养基，葡葡糖溶液氨液和消泡剂进行同时灭菌操作。
如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。
开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,直到冷却到发酵温度37 ℃。
利用硅皮管将25 g/100ml葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。
消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。
在发酵过程中，通气量控制在4L/min，搅拌转数为400rpm。
向发酵罐中接种之前已经扩大培养的菌种。
开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖流加混合液，使发酵罐内葡萄糖浓度达到25g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH为7.0，充入适量的消泡剂。
通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在30％左右。
每隔2h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度，并做记录。
取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。
当菌种停止繁殖时，菌种浓度不再增加，葡萄糖浓度不再改变时，停止发酵反应。
取发酵液样品，测定酵母菌浓度，还原糖，氨基氮，DO含量参数。
培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。
清洗培养罐。
3.6 实验数据的测定3.6．1斐林法测还原糖试剂：①斐林试剂② 0.1%标准葡萄糖溶液测定步骤：①斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5Ml。
置于250mL三角瓶中，加入10mL水，并从滴定管中预先加入约24mL0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5秒每滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min中内完成，总消耗量为V 0 mL。
②定糖：预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5mL，置于250mL三角瓶中，加入V 1 毫升试样稀释液（含葡萄糖量为 5 ～ 15 毫升）及适量多0 .1% 标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作。
总耗糖量为 V 2 毫升。
正式实验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5 毫升，置于 250mL 三角瓶中，加入 V 1 毫升试样稀释液和（ V 2 － 1）毫升 0.1% 标准葡萄糖溶液，补加 [（V 0 +10 ）－（ V 1 +V 2 ）] 毫升水，摇匀，以下操作同标定时操作，总耗糖量为 V 毫升。
3.6.1.3计算葡萄糖 =（ V 0 -V ）×C×n×1/V 1（ g/mL ）。
3.6.2氨基氮的测定基本原理氨基酸是有氨基与羧基得两性化合物，在溶液中以两性离子状态存在。
如：R-CH--COO-+2HCHO-NH3是弱酸，完全解离时pH在11-12之间或者更高，若用碱滴定- NH3释放出来的H+来测定氨基酸，一般指示剂的变色范围＜10，很难指示滴定终点。
但是用甲醛处理后，由于甲醛能与氨基结合使氨基上的氢离子游离，使溶液中的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色区域内（8.0-10.0）。
因此可用酚酞作指示剂，用碱来滴定，从而计算氨基酸的含量。
试剂：1mol/l盐酸，0.1mol/l氢氧化钠标准溶液，0.5mol/l氢氧化钠标准溶液，12%中性甲醛，0.2%甲基红指示剂，1%酚酞指示剂。
仪器及器具：100ml三角瓶，10ml刻度吸管，25ml刻度吸管，碱式滴定管取发酵离心上清液2.5ml至100ml三角瓶中，加水50ml，甲基红指示剂2滴，1mol/l盐酸1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液调节溶液至橙色（体积不计），使呈中性。
加12%中性甲醛10ml(每次用之前用氢氧化钠溶液调至微红色，酚酞作为指示剂)，摇匀静置10min,加1%酚酞指示剂5滴，用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定至微红色为终点。
计算：氨基氮（mg/100ml）=C×V×14.01×100/2.5C:氢氧化钠滴定液浓度，mol/lV：氢氧化钠滴定液消耗体积，ml3.6.3 OD法测菌体密度原理：OD表示被检测物吸收掉的光密度。
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
实验步骤首先对配好的培养基进行检测光密度，以此作为对照。
其次，用三支试管取10的样品液，分别用磷酸盐缓冲液稀释稀释不同的倍数，用wfj7200可见分光光度计在波长600nm下测定不同稀释不同稀释倍数的菌悬液以及对照样品的OD值。
计算:OD=㏒10(入射光/透射光）4.结果与结论表4.1大肠杆菌发酵液的OD值，氨基氮，还原糖数据从整个实验过程中测得的实验数据可以观察到：氨基氮和还原糖的含量从开始略有上升到后来维持稳定。
主要原因是大肠杆菌在繁殖中需要碳源转化为葡萄糖为其提供能量，将氮源转化为氨基酸为其提供合成自身产物的原料，随着菌体密度的不断增大，两者的含量也不断升高，知道菌体密度维持稳定后两者的含量才稳定下来。
在测量OD数据时，第二次测得的数据具有失真现象，应当不予考虑，从实验数据的整体来看整个OD 值的走势还是符合大肠杆菌生长曲线的。
大肠杆菌起初被接种在发酵罐内，由于对发酵罐内的生活环境还不适应，菌体的繁殖速率降低，代谢物产量几乎处于停滞阶段，此时期被定为适应期；接着菌体对整个生存环境有了适应，其数目呈现几何级数增长，代谢产物也在不断积累，此时期为对数期；处于稳定期的菌体其繁殖的菌体数与衰亡的细胞数达到动态平衡，菌体产量达到最高点，其次生代谢产物也在此时期进行积累；最终军中衰老，活的菌种数量逐渐下降。
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