磁性复合微球固定化脂肪酶的研究

２ ４ 酶活 的测定 方 法 ．
图 １ 戊 二 醛 浓 度 对 酶 固定 化 的 影 响
从 图 １可看 出 ， 当戊 二 醛浓 度 低 于 ８ 时 ， ％ 固定 化酶 的相对 酶 活随戊 二 醛 浓 度增 加 而增 大 ； 戊 二 当 醛浓度 继续 升高 ， 固定化 酶 的相对 酶 活则 有所 下 降 。
１５ ｌ ． ｍ 正硅 酸 乙酯 ， 同时 ３０／ ｎ速 度搅 拌 ， ０ｒｍｉ 室温下
１ 实 验 材 料 与方 法
１ １ 实验材 料及 仪器 ．
反应 ６ ｈ以上， 反应结束后 ， 永磁铁分离得到黑色 固 体， 用倾 注 法加去 离子水 和无 水 乙醇反 复洗涤 ， 真空
干燥得 到 Ｆ ＳＯ 粒子 。 ｅＯ ／ ｉ
第２ ８卷 第 ７期 ２１ ０ ２年 ４月
Ｇａ ｓ ｃｅ ａ ｄ Ｔ
． ８ ， ． ２ ｖ ７ ０
却 ２ １ ０２
磁 性 复合 微球 固定 化脂 肪 酶 的研 究
杨云裳 ， 邢兰坤 ， 张应鹏
于 ５ ｍ 质 量 分 数 为 ２ 、％ 、％ 、％ 、０ 、２ ０ｌ ％ ４ ６ ８ １ ％ １％ 的戊二 醛溶 液 中 ， 超声 处理 １ｍｉ， 慢振 荡 ２ ｈ 反 ５ ｎ慢 ０，
２２ 壳聚糖包裹的 Ｆ ， ９Ｏ 磁性复合微球 的 ． ｅＯ ／ ｉ
氨基化
取 ２５ ．ｇ磁性 复合 微球 于 ２０ 圆底烧 瓶 中 ， ５ ｍｌ 加
＝
３ 结 果 与讨 论
３ １ 固定 化条件 对酶 活的 影响 ．
３ １ １ 戊二 醛 浓度对 固定化 酶 活的 影响 ． ．
无 水 乙醇洗 ， 用去 离子 水洗 ， 再 真空 干燥 得到壳 聚糖 包 裹 的 Ｆ３ ＳＯ 粒 子 。 ｅ０／ ｉ２
取 ５ １ 氨基修饰后 的磁性复合粒子 ， 份 ｇ 分别置
燥， 得到氨基修饰的磁性复合纳米粒子 。 ２ ３ 以戊 二醛为 交联剂 制备 固定化 酶 ． 取 １ 氨基 修 饰 后 的磁 性 复 合 粒 子 ， 于 ５ ｍ ｇ 置 ０ｌ 定 浓度 的戊二 醛溶 液 中 ， 声 处理 １ｍｎ 慢 慢振 超 ５ ｉ， 荡 ２ ｈ 反应结 束 后 ， 永 磁 铁 分 离 ， 去离 子 水 洗 ０， 用 用
（ 兰州理工 大学 石 油化工学院 ， 甘肃 兰州 ７０ ５ ） ３０ ０ 摘 要： 用壳聚糖 和二氧化硅共同包裹 Ｆ， ４ ｅｏ 纳米粒子制得磁性高分子微球 ， 以此为载体 ， 并 以戊 二醛为交联剂固定
化脂肪酶 ， 探讨 了固定化 过程中戊二醛 浓度 、 固定化 时间 、 固定化 ｐ Ｈ对 固定化 酶活力 的影 响。结果 表明 ， 固定化脂
一
６２ 型 真 空 干燥 箱 ： 海 中友 仪 器 设 备 有 限 公 ０１ 上
影响了脂肪酶的商业 化。固定化脂肪酶， 不仅能保 持酶的高效性和专一性 ， 而且能大大地提高酶的操 作稳定性 ， 同时 ， 易于分离 ， 有利于酶的重复使用及 产品的纯化 。磁性高分 子微球作为酶 的固定 化 Ｊ
液 中各加 酚酞 指 示 液 ３滴 ， ００ ｍ ｌＬ氢 氧 化钠 用 ．５ ｏ ／ 标 准溶 液滴定 ， 至微 红 色并 保 持 ３ ｓ 褪 色 为 终 直 ０不
点， 记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积。 相 对酶 活性 的计 算公式 如 下 ：
Ｒ ＝ Ａ ｘ １ ０％ ０
式 中 ， 为相 对酶 活性 ； 每次 测 得 的脂 肪酶 活 性 Ａ为
人 １０ ｌ ０ ｍ 的甲苯 ， 声 ２ ｍｉ， 入 １ ｍ 一氨 丙基 超 ０ ｎ加 ０ｌ
应结束后 ， 用永磁铁分离 ， 用去离子水洗涤 ， 真空干 燥 ， 备戊 二醛 活化 的磁性 复合粒 子 。 制
三 乙基 硅烷 ， 然后 １０Ｃ油 浴连续 搅拌 回流 ４ ， ２ｏ ｈ 反应 结束后 ， 磁铁分 离 ， 甲苯 和丙 酮 各 洗 三次 ， 用 用 除去 未反 应 的 一 丙基 三 乙基 硅 烷 ， 经 ６ 真 空 干 氨 再 Ｏ
脂 肪酶 （ ｉａｅ Ｅ ． ． ． ． ） 也 叫三酰 基甘 油 Ｌｐ ｓ ， Ｃ ３ １ １３ ，
药集 团化学试 剂有 限公 司 ； 正硅 酸 乙酯 ： 津市 凯信 天 化学工 业有 限公 司 ； 无水 乙醇 ； 天津 市富 宇精细化 工
有 限公 司 ； 氨水 （ ５ ｔ ） 烟 台双 双 化 工 有 限公 司 ； ２ ｗ％ ：
ｐ ７５的条件下 ， Ｈ． 水解脂肪每分钟产生 １ ｍ ｌ ｉ ｏ 的脂 ￣ 肪酸， 即为一个脂 肪 酶 国际单位 ， Ｕ ｇ表示 。 以 ／
采 用橄 榄 油乳 化法 测定 脂 肪酶 的活性 ： 两个 取
中心产生束缚 ， 造成酶活力下降。故戊二醛最适 浓
度为 ８ 。 ％
３ １ ２ 固定化 时 间对 固定化 酶 活的 影响 ． ．
但 游离 脂肪 酶 价格较 高 ， 且后续 分离 步骤 困难 ，
限公 司 ； 聚乙烯醇 ： 京 百 利 化学 品开 发 中心 ； 榄 北 橄 油 和戊 二 醛 （５ ｔ ） 上 海 中秦 化 学 试 剂 有 限 公 ２ ｗ％ ：
司。 １２ 仪器设 备 ．
恒 温水 浴振 荡器 ： 常州 国华 仪 器 有 限公 司 ； Ｚ ＤＦ
这是因为戊二醛浓度较低时 ， 载体表面活性基团较 少， 载体机械强度差 ， 酶在粒子表面易脱落 。当戊二 醛浓度过高时 ， 除过量戊二醛 自 身发生羟醛缩合 ， 过 多的活性醛基导致酶分子与载体之 间形成 多点结
合 ， 样 会产生 空 间结 构 障碍外 ； 可能会 对 酶活 性 这 还
脂肪 酶 的 活 力 定 义 ： ｇ固 体 酶 粉 ， ４ ￣ ， １ 于 ０（ ２
１０ ｌ ０ ｍ 三角瓶 ， 分别 于标 记上空 白瓶 （ ） Ａ 和样 品瓶 （） ， Ｂ 中 各加 聚乙烯 醇橄 榄 油乳 化液 ４０ ｍ 和磷 酸 ．０ ｌ
缓 冲液 ５ ０ ｍｌ再 于 Ａ瓶 中加 入 ９ ％ 乙醇 １ ｍ ， ．０ ， ５ ５ ｌ于
称取 ５份 ００ ｇ戊二 醛活化 的磁 性 复合 微 球 分 ．５ 别浸 于 １ｍ 浓 度 为 ５ｍ ／ ｌ ０ｌ ｇｍ 的脂 肪 酶液 （ Ｈ ７５ ｐ ． ）
一
酰基水解 酶 ， 是一 类 特殊 的酰基 水解 酶 ， 能够 在油 它 水 界面 上催化 酯 水 解 、 合 成 、 交换 、 聚 物合 成 酯 酯 高 和立体异构拆分等有 机合成反应 Ｊ并且在强烈 ，
氨丙基 三 乙氧基 硅烷 ： 业纯 ， 京联 硅化 工有 工 南
脱水和有机体系中能保持高活性 、 高稳定性 和高区 域、 立体选择性 ， 因此被广泛应用于油脂水解 、 油脂 改性、 皮革加工 、 造纸工业、 洗涤剂工业 以及手性合 成【等领域 。脂 肪酶是 目前用 途最广泛的酶催 化 ４ 剂之一 ［ 。
载体 可借 助外 部 磁 场 方 便地 将 酶 回收 。近 年来 ， 磁
司； 紫外分 光光度 计 ： 贵州 赛 兰博科 技有 限公 司。
２ 实 验方 法
２ １ 磁 性 复合微球 的 制备 ．
称 取 Ｆ Ｃ３・ Ｈ Ｏ １ １ ７ ｇ和 Ｆ Ｃ２・ Ｈ Ｏ ｅ １ ６ ２ ．６ ４ ｅ１ ４ ２ 性高分子载体 固定 脲酶 、 糖化 酶等 的研究 已有 报 ０ ５ ２ ｇ 入三 口烧 瓶 中 ， 入 ４ ． ｍ 去 离 子 水 ， ．７４ 加 加 ３０ ｌ 道 一 ’引。 使得 ｎ Ｆ¨ ）＝ ．ｍ ｌＬ， 气保 护下 机械 搅 拌 ， （ｅ ０１ ｏ 氦 ／ 加 壳 聚糖是 一种 Ｎ一脱 乙酰 基 葡 萄 糖 聚合 物 ， 其 热 到 ６ ℃ ， 人氨水 （５ ｔ ）．ｍｌ恒 温 １ｍｎ 升 ０ 加 ２ ｗ％ ６５ ， ０ ｉ， 分子表面含有丰富的氨基和羟基 ， 生物相容性好 ， 无 温 到 ８ ℃ ， 续 恒 温 ６ ｒｉ， 拌 速 度 大 约 为 Ｏ 继 ０ ｎ 搅 ａ 毒 无副作 用 。 目前 已 被 用于 多 种 酶 的 固定 ， 葡 萄 如 ３０／ ｉ， 应 完 成 后 ， 永 磁 体 分 离 得 到 黑 色 固 ０ ｒｍｎ 反 用 糖 氧化 酶 、 胃蛋 白酶 、 １ ３一甘 露 聚糖 酶 、 Ｌ一天 门冬 酰 体， 用倾 注法 向容器 中加 入 一定 量 的去离 子水 和 无 胺 酶等 “ｏ 水 乙醇 ， 反复洗 涤 ， 得磁 性流体 。 制 本研究以壳聚糖和二氧化硅共同包裹 Ｆ， ｅ 纳 Ｏ 将 上述制 得 的 Ｆ 粒 子 ， 入 ２Ｏ ｌ 水 乙 ｅＯ 加 ０ｒ 无 ａ 米粒子制得磁性高分子微球为载体 ， 采用戊二醛 为 ５ｍｌ 为 ｅＯ 交 联剂 固定脂 肪 酶 ， 讨 了 固定 化 的工艺条 件 ， 探 并对 醇 ，０ 的去离 子水 ， 保证 Ｆ 粒 子完 全 分 散 ， ６ ｗ 超声 １ｍｎ 然后加 人 ３ ｌ 水 （５ ｔ ）滴 加 ０ ５ ｉ， ｍ氨 ２ ｗ％ ， 固定化 酶 的性 质 进行 研究 。
中 ， 荡 反应 ２、 、 ８ １ 、２、４ １ 、８ ， 涤 干 燥 振 ４ ６、 、０ １ １ 、６ １ ｈ 洗 得 到固定 化脂 肪酶 。
４ ℃水浴预热 １ｍｎ 然后 ， ０ ０ ｉ， 在两瓶中各加待预测酶
液 １ ０ ｍ ， 即混匀计 时 ３ ｍ ｎ 在 Ｂ瓶 中立即补 加 ．０ ｌ立 ０ ｉ， ９ ％乙醇 ｌ ． ｏｎ 终止反 应 ， 出 ； ５ ５ ｏ ｒｌ 取 于空 白和样 品溶
一
涤， 真空干燥， 即为戊二醛活化的磁性复合粒子 。 用 ｐ ６ ８的 Ｎ ２ Ｐ Ｎ Ｈ Ｐ ４ Ｈ ～ ａＨ Ｏ 一 ａ ２Ｏ 缓冲溶液配
制 一定浓度 的脂 肪酶 液 １ｍ ， ０ ｌ取戊 二醛 活化 后 的磁 性微 球载体 ００ ｇ 于 ２ ￣ 转 速 １０／ ｎ下 ， ．５ ， ５Ｃ、 ５ｒｍｉ 在水 浴恒 温振荡 器 中振荡 反应不 同时间 ， 后 ， 固定化 然 将 脂肪 酶用永 磁铁 分离 ， 用磷 酸缓 冲溶液 洗涤 多次 ， 并 将其 置于真 空 干燥箱 中室 温下过 夜 干燥 。