基于活性和基因从海洋微生物中筛选烯二炔类抗生素

计引物，以期用序列 筛 选 的 方 法 对 我 们 的 微 生 物 菌 种产烯二炔物质的潜力进行评估。
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌 种： 活 性 筛 选 指 示 菌 为 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli） BR513-80。 该 菌 含 有 溶 源 性 λ 噬 菌体，并且通过基因改造将 β-半乳糖苷酶 放 在 λ 噬 菌体 pL 启动子的下游。溶源性 λ 噬菌体在正常情 况下并不会裂解，而 是 会 随 着 大 肠 杆 菌 生 长 一 起 复 制 ，但 是 在 某 些 特 殊 情 况 下 如 ，烯 二 炔 类 抗 生 素 能 引 起大肠杆菌的 DNA 损 伤，引 起 SOS 效 应，使 溶 源 性 λ 噬菌体脱离 溶 源 过 程 而 进 入 裂 解 过 程，从 而 启 动 了 pL 启动子 使 得 β-半 乳 糖 苷 酶 得 以 表 达 （ 图 1 ） 。 通过添加该酶的底 物，检 测 颜 色 或 者 荧 光 变 化 就 可 以判断 β-半乳糖苷酶活性，进 而 判 断 是 否 存 在 烯 二 炔 类 物 质［12 ］。
微生物次生代 谢 产 物 是 药 物 的 重 要 来 源，在 抗 感染和抗肿瘤领域超过 50% 的药物 都 来 源 于 或 者 衍生自 天 然 产 物［1］。 所 以 构 建 一 个 高 质 量 的 微 生 物库及天然产物库是保证筛选成功的前提和关键， 而如何对构建的微生物库以及天然产物库进行质量 评价则 是 摆 在 我 们 面 前 的 重 要 问 题［2］。 目 前 的 质 量 评 价 方 式 主 要 是 对 代 谢 产 物 的 多 样 性 ，如 分 子 量 ， 化学结构等的多样 性，以 及 代 谢 产 物 的 丰 度 进 行 评 估 ，然 而 却 无 法 反 映 活 性 化 合 物 出 现 的 几 率 ，因 此 对 我们构建的海洋微生物天然产物库进行活性筛选可 以反映我们天然产物库的质量。
图 1 大肠杆菌 BR513-80 的基因型 Fig. 1 The genotype of Escherichia coli BR513 -80.
产烯二炔类抗生素的阳性菌马杜拉放线菌 Actinomadura madurae AS 4. 1224T 和 Actinomadura verrucosospora AS 4. 1512T 均为中国科学院微生物所 菌 种 保 藏 中 心 赠 送。 阿 维 链 霉 菌 Streptomyces avermitilis 和 天 蓝 色 链 霉 菌 Streptomyces coelicolor 则 为本实验室保藏。 1. 1. 2 培 养 基 和 溶 液：① 大 肠 杆 菌 Escherichia coli BR513-80 的生长培养基为 LBE 培 养 基，E-salt 及 Zbuffer 等配制 均 按 照 参 考 文 献［12 ］。 ② 放 线 菌 活 化均采用通用 的 高 氏 一 号 培 养 基。 ③ M3 培 养 基： 每升含 10 g 玉米淀粉，5 g 药媒，1 g 碳酸 钙，0. 05 g CuSO4 ·5H2 O，0. 5 mg NaI。 1. 1. 3 主要试剂和仪器：分子生物学常用酶购自大 连 宝 生 物； 4-甲 基 伞 形 酮 葡 萄 糖 苷 酸 （ 4Methylumbelliferyl β-D-glucuronide， MUG ） 购 自 AppliChem，其 为 β-半 乳 糖 苷 酶 的 底 物，β-半 乳 糖 苷 酶将糖苷键 断 裂 从 而 释 放 出 荧 光 基 团 MU，通 过 检 测 荧 光 判 断 β-半 乳 糖 苷 酶 的 活 性［13］； 酶 标 仪 为
基于活性和基因从海洋微生物中筛选烯二炔类抗生素
裴刚1，2# ，代焕琴1# ，任彪1，2 ，刘向阳1 ，张立新1*
（ 1 中国科学院微生物研究所，北京 100101） （ 2 中国科学院研究生院，北京 100049）
摘要：【目的】高质量的海洋微生物菌种库及其天然产物库是新药开发的重要来源 。 在本研究中我们通过筛 选新的烯二炔类抗生素来对已经构建的 海 洋 微 生 物 天 然 产 物 库 进 行 质 量 评 价。 【方 法 】首 先 我 们 根 据 烯 二 炔类抗生素能引起 DNA 断裂的活性构建了活性筛选模型，并对我们的天然 产 物 库 进 行 筛 选；其 次 根 据 合 成 烯二炔核心结构的独特且保守的重复 I 型聚酮合成酶设计了引物，通过 PCR 扩增的方法对海洋微生物库进 行序列筛选。【结果】通过活性筛选 从 我 们 的 海 洋 微 生 物 天 然 产 物 库 中 获 得 一 个 阳 性 的 发 酵 产 物。对 该 阳 性菌（ LS481 ） 的 系 统 发 育 学 分 析 表 明 该 菌 属 于 能 产 生 烯 二 炔 类 化 合 物—Dynemicin 的 Micromonospora chersina，对其发酵产物 TLC 分析证明该菌确实产生 Dynemicin 类化合物。通过基因 筛 选 得 到 了 2 个 具 备 合 成烯二炔核心结构聚酮合成酶的菌株，16S rRNA 基 因 分 析 显 示 其 中 一 个 很 可 能 为 灰 色 链 霉 菌 （ MS098 ） ，另 外一株菌则同 Streptomyces vinaceus NBRC 13425 T 和 Streptomyces cirratus NRRL B-3250 T 最相近。【结论】我们 的活性筛选模型能够有效获得烯二炔 类 物 质，结 合 基 因 筛 选 能 够 进 一 步 获 得 可 能 产 生 烯 二 炔 物 质 的 菌 株。 初筛结果也再一次验证了我们海洋微生物天然产物库的质量较好。 关键词： 烯二炔类抗生素；高通量筛选；重复 I 型聚酮合成酶 中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 （2010） 04-0472-06
C-1027 和 Calicheamicin 合 成 基 因 簇 的 阐 明 揭 示，无论九元烯二炔 还 是 十 元 烯 二 炔 其 核 心 结 构 都 是由一个独特的重复 I 型 聚 酮 合 成 酶 （ PKSE） 合 成
基金项目：科技部国际科技合作项目（2007 DFB31620 ） ；国家“863 计划”（2007 AA09Z443 ） ；中国科学院方向性项目（ KSCXZ-YW-G-013） * 通信作者。Tel / Fax： + 86 -10 -62566511 ；E-Mail： Zhanglixin@ im. ac. cn 作者简介：# 对文章具有同等贡献。裴刚（1985 -） ，男，河南信阳人，硕士研究生；代焕琴（1974 -） ，女，博士，主要从事天然产物 化 学 以 及 高 通 量筛选 收稿日期：2009 -10 -20；修回日期：2009 -11 -11
培养至 OD600 为 0. 1 － 0. 15。在 96 孔板中每孔加入 2 μL 的 待 试 样 品，然 后 均 加 入 80 μL 上 述 培 养 物。 将该 96 孔板放在 37℃ 培养箱中培养 3 h。由于丝 裂霉素 C 能引起双链 DNA 的 交 联，导 致 SOS 效 应， 因而采用丝裂霉素为正对照。在透明底黑色 96 孔 板中加入 80 μL 的 Z-buffer，25 μL MUG（1 mg / mL） 以及 30 μL 上述 96 孔板中的培养物。室温下放置 15 min，最后加入 30 μL 的 1M 碳酸钠终止反应。然 后用酶标仪测定 360 nm 波长激发下 460 nm 的荧光 强度。 1. 4 放线菌 DNA 提取以及系统发育学分析
取 10 μL 冻 存 的 E. coli BR513-80 接 入 5 mL LBE 培养 基 中，200 r / min，37℃ 过 夜 培 养。 然 后 将 过夜培 养 物 用 LBE 培 养 基 稀 释 至 OD600 0. 05，继 续
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Gang Pei et al. / Acta Microbiologica Sinica（2010）50（4）
EnVision Multilable Reader （ PerkinElmer， USA ） ； PCR 仪为 TaKaRa PCR Thermal Cycler。 1. 2 海洋微生物天然产物库制备
首先将在 － 80℃ 甘油管中保藏的海洋微生物菌 悬液在高氏天 冬 素 培 养 基 上 活 化 ，待 长 出 菌 落 后 ，挑 单 菌 落 接 入 高 氏 一 号 液 体 培 养 基 中，28℃ ， 200 r / min 培养 2 － 4 d；吸取 1 mL 上述种子液至 6 种 不同的发酵培养基中，28℃ ，200 r / min 培养 7 d；发酵 完成后将发酵液倒入 50 mL 离心管中，再加入 2 mL 的 HP20，振摇 4 h 使之充分吸附，6000 × g 离心5 min， 去除残 余 的 液 体； 然 后 冷 冻 干 燥 24 h，向 干 燥 后 的 HP20 和菌体中加入 6 mL 甲醇，振摇 4 h，6000 × g 离 心 5 min，收集甲醇萃取液；然后分别分装到 96 孔深 孔板和浅孔板中，挥干，加入 DMSO 备用。 1. 3 基于烯二炔类物质活性的高通量筛选模型
烯二炔类 （ Enediyne） 抗 生 素 是 微 生 物 产 生 的，
也是迄今 为 止 发 现 的 抗 肿 瘤 活 性 最 高 的 天 然 化 合 物，这个家族中的一 些 成 员 的 活 性 比 目 前 临 床 上 经 常使用的抗肿瘤抗生素-阿 霉 素 还 高 5000 － 8000 倍 以上［3］。烯二 炔 所 有 成 员 都 拥 有 一 个 由 双 键 偶 联 两个炔键构成的烯 二 炔 核 心 结 构，根 据 核 心 结 构 大 小 不 同 ，分 为 两 类 ：九 元 环 烯 二 炔 类 和 十 元 环 烯 二 炔 类［4］。烯 二 炔 极 强 的 活 性 主 要 依 赖 于 其 新 颖 的 DNA 损伤机制，而这一机制 损 伤 则 是 由 烯 二 炔 独 特 的分子结构决定的。
裴刚等： 基于活性和基因从海洋微生物中筛选烯二炔类抗生素. / 微生物学报（2010）50（4等根据负责烯二炔核心结构的保 守序列 设 计 了 兼 并 引 物 用 来 扩 增 PKSE［8］。 Farnet 等运用基因组扫描的方法发现以前没有报道产生烯 二炔 的 放 线 菌 中 具 有 合 成 烯 二 炔 核 心 结 构 的 PKSE，并通过优化发酵培养基最终从这些菌种得 到 烯 二 炔 类 物 质［9 ］。
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50（4） ：472 － 477； 4 April 2010 ISSN 0001 － 6209； CN 11 － 1995 / Q http： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn
Research Paper 研究报告
尽管烯二炔类抗生素缺乏组织特异性并且具有 很大的毒性，但是临 床 上 可 以 通 过 靶 向 给 药 以 降 低 其毒性。如 Calicheamicin 同 CD33 抗体 连 接 靶 向 治 疗急性白血病。所以筛选新的高效的烯二炔类物质 对于开发新的抗肿瘤药物是非常有意义的。微生物 天然产物是药物的 重 要 来 源，我 们 实 验 室 已 经 构 建 了一个高质量的海 洋 微 生 物 天 然 产 物 库，并 从 中 筛 选到一些有 潜 力 的 化 合 物［10 － 11］。 在 本 实 验 中 我 们 利用烯二炔类抗生素独特的活性构建了一个高通量 的烯二炔活性筛选 模 型，希 望 从 我 们 的 微 生 物 天 然 产物库中得到新颖的烯二炔类物质；并且我们又根 据负责合成烯二炔核心结构的 PKSE 的保守序列设