荧光测定黄酮
槲皮素-镓(Ⅲ)-十二烷基磺酸钠荧光体系及其在测定中药槐米、银杏叶、陈皮中黄酮的应用
槲皮素-镓(Ⅲ)-十二烷基磺酸钠荧光体系及其在测定中药槐米、
银杏叶、陈皮中黄酮的应用
余琳;吴晓桦
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2007(043)008
【摘要】在微酸性的酸度条件下,在SLS介质中镓(Ⅲ)与槲皮素形成n[镓(Ⅲ)]:n(槲
皮素)=1:1的黄色荧光络合物,激发波长为435.4 nm,发射波长为485.6 nm,槲皮素的浓度在4.0×10-7～3.2×10-6mol·L-1范围内与荧光强度呈线性关系,检出限为1.79×10-10mol·L-1.用该方法分析了几种中药,测定结果的RSD(n=8)值在
0.23%～0.64%之间,回收率在90.1%～101.3%之间.
【总页数】3页(P632-634)
【作者】余琳;吴晓桦
【作者单位】广东工业大学,轻工化工学院,广州,510090;广东工业大学,轻工化工学院,广州,510090
【正文语种】中文
【中图分类】O657.32
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尚红霞;邱治平
3.槲皮素-Al^(3+)-十六烷基三甲基溴化铵体系荧光光度法测定总黄酮 [J], 张海容;梁晓春;陈金娥
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槲皮素-镓(Ⅲ)-十二烷基磺酸钠荧光体系及其在测定中药槐米、银杏叶、陈皮中黄酮的应用
Ｋｅ ｗｏ ｄ ：Ｆ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｐ ｏｏ ｔｙ Ｑｕ ｒｅｉ ； ａｌ ｍ（ ； ｏ ｉｍ ｕ ｙ ｓ ｌ ｎ ｔ ￣ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅ ｅ ｙ ｒ ｓ ｌｏｏ ｐ ｃｒ ｈ ｔｍｅｒ ； ｅｃ ｔ Ｇ ｌｕ Ⅲ） Ｓ ｄ ｏ ｎ ｉ ｕ ｌ ｒ ｌ ｕｆ ａｅ Ｔｒｄｔ ｎ ｌ ｈｎ ｓ ａ ｏ ｉ
ｓ ｍｅｔａ ｉｉｎ ｌ ｉｅｅｍｅ ｉｉｅ ｇｖｎ ａｕ ｓｏ Ｄ 一 ８ ｎ ｅｏ ｅｙｉ ｈ ａ ｇ ｓｏ ． ３ － ０ ６ ａ ｄ ｏ ｒｄｔ ａ ｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｉｇｖ ｌｅ ｆ ｏ Ｃｈ ＲＳ Ｓ（ ）ａ ｄｒｃ ｖ ｒ ｔｅｒｎ ｅ ｆ ２ ｎ ０ ．素 （ ｅｃｔ ） 其 甙 是 植 物 界 分 布 最 广 Ｑｕｒｅｉ 及 ｎ
的黄酮 醇衍生 物 ， 也是 许多天 然 中草 药 的主要 成分 ，
具 有 多种生物 活性 及药 物 作用 ， 人 类 生命 科 学 中 在 有 重要 的研 究 价 值 。槲 皮 素 是 属 羟 基 黄 酮 类 化 合 物， 化学 名为 ３ ５７ ３，＇ 羟 基 黄 酮 ， 名 栎 精 。 ， ， ， ４－ 五 又 目前 ， 测定 槲皮 素 的方 法 主要 有 ： 层 色谱 法 、 薄 高效
Ｆｕ ｒｓｅ ｃ ａｔ ｎＳ ｓｅ ｏ ｅｃｔ ，Ｇａｌ ｍ（ ｌｏｅｃｎ ｅＲｅｃｉ ｙｔｍ ｆ ｏ Ｑｕ ｒｅｉ ｎ ｌ ｕ Ⅲ）ａ ｄＳ ｄｕ ａ ｒ ｌ ｉ ｎ ｏ ｉ Ｌ ｕ ｙ ｍ
Ｓ ｌｏ ｔ ｎ ｔ ｐｌｃ ｔｏ ｏ ｔ ｅＤｅｅ ｍ ｉ ｔｏ ｆＦｌ ｖ ｎｅ ｎ ｕ ｆ ｎａ ｅａ ｄ ＩｓＡｐ ｉ ａ ｉｎ ｔ ｈ ｔｒ ｎａ ｉｎ ｏ ａ ｏ ｓｉ Ｓ ｐ ｒｎ，Ｆｏ ｉ ｎｋｇ ｌｂａ ａ ｄ Ｄｒｅ ｎ ｇ ｒｎ ｏ ｈｏ ｉ ｌｕ Ｇｉ ｍ ｏ Ｂｉｏ ｎ ｉｄ Ｔａ ｅ ｉ ｅ
利用荧光分析法测定玉米须中的总黄酮含量
利用荧光分析法测定玉米须中的总黄酮含量曹叶霞;张海容;尹爱萍;何盛宝【摘要】A new method for total flavanoid determination in cornsilk was established based on the reaction of total flavanoid with alumimumion to form fluorescent material.The sample was extracted with 60％ ethanol by ultrasonic extraction under 400W for 20min.Total flavanoid was determined by spectrofluorophotometer with rutin as standard referenceat the excitation wavelength of 436 nm and the emission wavelength of 483 nm.The detection limit was 1.08 x 10-9 mol/L.The range of linearity with concentration of rutin was between 0 ～ 0.02 mg/mL, linearity relationship y=216.63x+137.93, correlativity 0.999 7, average rate of recovery 98.3％～ 100.8％, and RSD 0.88％.The method is simple, rapidand accurate with a bright future in analytical applications.%根据黄酮类化合物能与Al(3+)形成稳定的荧光络合物,建立一种测定玉米须总黄酮的新方法.用60%乙醇溶液,在功率400 W下超声处理20 min,提取玉米须有效成分;以芦丁为标样,选择激发波长为λ(ex)=445 nm,发射波长为λ(em)=542 nm,采用荧光分光光度法测定玉米须中总黄酮含量,并进行加标回收实验,以验证方法的准确性.方法检出限为1.08 x 10(-9)mol/L,线性范围在0-0.04 mg/mL之间;线性回归方程:y=216.63x+137.93,相关系数r=0.9997,平均回收率为98.3%-100.8%,相对标准偏差(RSD)为0.88%.这种方法操作简便、快速、准确,具有良好的分析应用前景.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2011(039)002【总页数】3页(P133-135)【关键词】荧光分析法;玉米须;总黄酮;测定【作者】曹叶霞;张海容;尹爱萍;何盛宝【作者单位】忻州师范学院化学系,山西忻州,034000;忻州师范学院化学系,山西忻州,034000;忻州师范学院化学系,山西忻州,034000;忻州师范学院化学系,山西忻州,034000【正文语种】中文【中图分类】R284.1玉米须为禾本科玉蜀属植物玉米（Zea mays L.）的花柱和柱头，它含有多种化学成分，如挥发油、皂苷、生物碱、黄酮类、多聚戊糖、尿囊素、有机酸等。
总黄酮含量测定方法
总黄酮含量测定方法
总黄酮是一类化合物的总和，常用的测定方法有色谱法、光谱法和比色法等。
1. 色谱法：色谱法是一种常用的分离和测定化合物的方法。
常用的色谱方法包括高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）等。
其中，HPLC是最常用的测定总黄酮含量的方法。
它可以将样品中的黄酮分离开，并通过检测器测量它们的浓度。
2. 光谱法：光谱法是利用物质对光的吸收、发射、散射等特性进行测定的方法。
常用的光谱法包括紫外-可见光谱法（UV-Vis）和荧光光谱法等。
这些方法通过测量样品在特定波长下的吸光度或荧光强度来确定总黄酮含量。
3. 比色法：比色法是通过比较样品与标准溶液的颜色差异来测定样品中的化合物含量的方法。
通常使用染色剂与样品中的黄酮发生反应，形成有色产物，并通过比色仪或分光光度计测量吸光度，进而计算总黄酮的含量。
需要注意的是，不同的测定方法可能对不同类型的总黄酮有不同的适用性和灵敏度。
因此，在选择测定方法时，需要考虑样品的特性和实验室的仪器条件，确保能够准确测定总黄酮的含量。
第六章黄酮类化合物--鉴定
第6章 黄酮类化合物
----黄酮类的鉴定
鉴
定
一、薄层色谱法（TLC） 二、 纸色谱法（PC)
一、 薄层色谱法
（1）硅胶薄层色谱: 用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物 （2）聚酰胺薄层色谱：分离含游离酚羟基的黄酮苷与苷元。 展开剂：具有较强的极性，大多含有醇、酸或水 如：乙醇－水（3：2）， 水－乙醇－甲酸－乙酰丙酮(5:1.5:1:0.5)
9
习题
有下列四种黄酮类化合物 A、 R 1＝ R2＝ H B、R1＝H, R2＝Rha C、R1＝Glc, R2＝H D、R1＝Glc, R2＝Rha
R2O O OH
OR1 OH O
比较其酸性及极性的大小: 酸性( )＞( )＞( )＞( ) 极性( )＞( )＞( )＞( ) 比较这四种化合物在如下三种色谱中Rf值大小顺序: (1)硅胶TLC(条件CHCl3—MeOH 4:1展开), Rf值( )＞( )＞( )＞( ) (2)聚酰胺TLC(条件60%甲醇—水展开), Rf值( )＞( )＞( )＞( ) (3)纸色谱(条件8%醋酸水展开), Rf值( )＞( )＞( )＞( )
OH O C O D glc-O O A O O OH OH OH B glc-O O OH
聚酰胺薄层
(乙醇／水）
二、纸色谱法（PC)
PC适于分离各种天然黄酮类化合物及其苷
类的混合物。
黄酮苷：一般采用双向展开
BAW 第一向
样 第二向 HOAc
样
黄酮类化合物的检识和结构鉴定
第一相展开采用醇性展开剂 如: BAW n-BuOH: HOAc:H2O=4:1:5上层 TBA t-BuOH: HOAc: H2O=3:1:1 水饱和n-BuOH 层析行为: Rf值: 苷元>单糖苷>双糖苷 一般:苷元在0.70以上，而苷则小于0.7。 第二相展开采用水性展开剂 如：2~6% HOAc水溶液 3% NaCl 水溶液 HOAc:浓HCl:H2O= 30: 3 : 10
黄酮类化合物的理化性质及显色反应
二、溶解性 一般来说，游离苷元难溶或不溶于
水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、 乙醚等有机溶剂及稀碱液中。 黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强 的分子，难溶于水;而二氢黄酮及二 氢黄酮醇等非平面分子，分子间排 列不紧密，分子间引力较低，有利 于水分子进入，易溶于水。
花色苷元（花青素）类以离子形式存在， 水中溶解度较大。黄酮类苷元分子中羟 基数越多，水中的溶解度越大。
OH
O 芸香糖 OH O 芦丁
颜色：
黄酮的色原酮部分无色，在 2- 位上引入 苯环后，即形成交叉共轭体系，使共轭 链延长，因而呈现出颜色。黄酮、黄酮 醇及其苷类多显灰黄~黄色，查耳酮为黄 ~橙黄色，异黄酮类显微黄色，二氢黄酮、 二氢黄酮醇不显色。
在上述黄酮、黄酮醇分子中，尤其在 7位及 4’- 位引入 —OH 及 —OCH3 等供电基 （助色团）后，通过电子转移、重排使 化合物的颜色加深，但在其它位置引 入—OH、—OCH3等供电基影响较小。 花色素及其苷元的颜色随 pH 不同而改变， 一般显红色( pH 7 )、紫色( pH8.5 )、蓝 色( pH8.5 )等颜色。
H O R O H 花 青 素 O X或 O H
-
二 氢 黄 酮
黄酮苷类，因为引入糖，水溶性比相应 苷元为大；糖链越长，则水溶度越大， 一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶 剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机 溶剂中。
三、酸碱性
酸性
黄酮类化合物因分子中多含有游离酚羟 基，故显酸性，可溶于碱性溶液中。酸 性强弱顺序依次为：7，4’-二OH 7-或 4’-OH 一般酚OH 5-OH 。此性质可用 于提取、分离及鉴定工作。
2、 铅盐：
常用 1% 醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，
6.7-黄酮类化合物 -检识技术.
（2）金属盐类的络合反应
① 三氯化铝反应：
操作方法 ：在滤纸上滴加样品液，再滴加1%三 氯化铝乙醇溶液，通过纸斑点反应观察现象。 现象：大多数黄酮显黄色并有荧光。 例外 4'-OH或7，4'-二OH黄酮醇显天蓝色荧光。 鉴别意义：黄酮类化合物的定性定量分析。
（2）金属盐类的络合反应
② 锆盐—枸橼酸反应
1—2分钟
显色
现象：黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）： 显橙红～紫 红色；查耳酮、橙酮、儿茶素： （—） 阴性 注意 查耳酮、橙酮、儿茶素类则不显反应；异黄酮除少数 例外，均不显色； 花色素在浓盐酸中也会发生色变，须先作空白对照实 验。
（1）还原反应
②四氢硼钠反应
操作：样品 /甲醇 + NaBH4的甲醇液
（2）金属盐类的络合反应
③ 醋酸镁反应 操作：在滤纸上滴加样品液，喷以醋酸镁的甲醇液，加热干 燥后观察纸班点现象。
现象：二氢黄酮(醇)：天蓝色荧光 异黄酮、黄酮(醇) ：黄-橙黄-褐色荧光 鉴别意义：用于二氢黄酮、二氢黄酮醇类与其他黄酮类化合物 的区别检识。
（2）金属盐类的络合反应
④ 氨性氯化锶反应
操作：将样品的甲醇液置小试管中，加入 3滴 0.01mol/L氯化锶甲醇液，再加3滴已用氨蒸气饱 和的甲醇溶液，
现象：具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物: 绿～棕色及至黑色沉淀。
鉴别意义：具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物
（3）碱性试剂反应
① 二氢黄酮类遇碱变成相应异构体查耳酮显橙或黄色
OH HO O OCH 3 OH
（2）纸色谱
【用途】适用于各种黄酮类化合物及其苷类的分析；
【展开剂】 黄酮类化合物一般宜用极性相对较小的“醇性”溶剂展开 ； 黄酮苷类宜用极性相对较大的“水性”展开剂 ； 黄酮苷和苷元混合物的分离和检识常用双向纸色谱法，第一向通 常用“醇性”展开剂展开，第二向用极性大的“水性”展开剂展 开。
分析化学检识鉴别 (黄酮)
还原反应
盐酸-镁粉反应
1、多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇显红~紫红色
2、少数显蓝、绿色，B环上有-OH或-OCH3颜色随之加深
3、查耳酮、橙酮等无该显色反应；花色素引起假阳性反应
钠汞齐还原反应
1、黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢异黄酮类显红色
2、黄酮醇类显黄色~淡红色；二氢黄酮醇显棕黄色
三萜类化合物和甾体类化合物颜色鉴别反应大致相同
生物碱的沉淀反应很颜色反应
沉
淀
反
应
碘化铋钾试剂
即KbiI4，生成橘红色至黄色无定形沉淀
碘化汞钾试剂
即K2HgI4，生成类白色沉淀
碘-碘化钾试剂
即KI--I2，生成红棕色无定形沉淀
硅钨酸试剂
即SiO2·12WO3·nH2O，生成类白色或淡黄色沉淀
苦味酸试剂
Sabety反应
5%溴的氯仿液，产生蓝、紫、绿
Ehrlich反应
产生紫色或红色
对二甲胺苯甲醛
室温显蓝色，氢化yu在80℃加热10min显蓝色，继而转为绿色，最后转为黄色，在水蒸汽上蓝色可再现
通用显色剂...
硫酸
110℃出现颜色或荧光
五氯化锑
萜醇由灰到紫蓝，加热转为棕色；紫外灯下棕色荧光
三氯化锑
萜醇由灰到紫蓝，加热转为棕色；紫外灯下棕色荧光
无沉淀
沉淀
鞣质的化学性质
还原性
酚羟基多，易被氧化，能还原菲林试剂
与蛋白质沉淀
结合产生不溶于水的沉淀，作为提纯、鉴别的方法之一
与重金属沉淀
沉淀，在提取分离中此方法可除去鞣质
与生物碱沉淀
沉淀，在提取分离中此方法可除去鞣质
与三氯化铁作用
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基于荧光光谱法对银杏黄酮糖苷的检测研究1 温宗壮 中国矿业大学化工学院生物工程11-2
摘要：银杏黄酮糖苷因具有多种生物活性而被制药、食品、日用品等诸多领域广泛应用。针对目前银杏黄酮糖苷检测操作繁琐、成本高、耗时长的不足，建立了一种高精确性、低成本的快速测定方法。根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，以芦丁为标样探索测试条件，结果表明在激发波长λex=400 nm，发射波长λem=520 nm，pH为3.6 的Al（NO3）3-（HAc-NaAc）反应体系中反应1500 s，螯合物荧光强度趋于稳定且达到最大值。求得芦丁浓度与荧光值的线性回归方程为y=29.92x+36.49（R2=0.986），线性范围为1.8×10-6～3.2×10-5 mol/L。用这种方法检测了银杏悬浮培养细胞中黄酮糖苷的含量，并进行加标回收实验，平均回收率为101.3%。该方法灵敏度高，重现性好，操作简单，具有良好的应用前景。 关键词：荧光光谱法 银杏 黄酮糖苷 引言 银杏黄酮具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等诸多作用，是生物制药、保健食品、功能性产品、化妆品和动物饲料添加剂等诸多行业产品开发的主要原料[1]。紫外可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV）、高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography, HPLC）等方法是常用于检测植物中黄酮类化合物的手段。其中UV法是最传统、应用最广泛的方法。Zhu等利用紫外可见分光光度法对5种提取马齿苋黄酮方法的结果进行了检测[2]。Wang等也在刺五加上用同样的方法做过类似的研究[3]。但是该种方法用于测定植物中未经纯化的黄酮粗提物，结果会很大程度上受到杂质的干扰，这已经成为不争的事实。其原因在于许多提取物中常见的杂质如咖啡酸和鞣质也具有邻苯二羟基结构，也能参与Al3+的显色反应，使得测定结果会比实际值偏高。HPLC法测定结果相对准确，但设备昂贵、仪器维护成本高、使用费时且测定各成分时需要标准品对照，
使用成本也高，实力一般的科研机构难以接受，通常为了得到更为精确的组分信息，经常与质谱（mass spectrum, MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）等手段连用，进行定性定量检测。Qing等利用HPLC-MS结合13CNMR法从月季中鉴定了4个黄酮糖苷[4]。Anja[5] 、Zhao[6] 、Chang[7]等都从不同的生物样本中分离鉴定了多种黄酮类化合物。毛细管电泳法在分析植物次生代谢物方面也有许多报道。在检测银杏黄酮组分中也已经有了应用。Zhang等用毛细管电泳法检测了菊花黄酮，建立了浓度与电流响应的线性关系[8]。Chi等利用毛细管区带电泳分离检测了中国凉茶中几种黄酮物质，这种方法能高效分离、省时、所需样品少、重现性好[9]。但其具有HPLC法一样的缺点。此外气相色谱法在黄酮类化合物的分析中应用很少，这主要是由于黄酮类化合物不耐受高温，检测前需利用衍生化试剂将其衍生化，增加了实验成本，操作复杂，不被广泛采用。 根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，本文建立了以芦丁为标品的银杏黄酮糖苷荧光光谱法（Fluoro-spectrophotometry method，FSM）的检测手段。Serbia等曾研究了荧光分光光度法对人血清桑色素的检测，以液相色谱法的检测结果为对照，表明两种方法的相对标准误差在可接受范围内，荧光分光光度法是可靠的[10]。本试验中以银杏悬浮培养细胞为样品提取黄酮糖苷并测定其含量，为植物药的开发利用提供了有力保障。 1 实验部分 1.1试验材料与试剂 银杏细胞为本实验室培养所得，烘干并碾成粉末，贮存于干燥器中暗处保存备用。氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、芦丁均为分析纯及色谱级甲醇产自国药集团化学试剂有限公司。槲皮素、山萘素和异鼠李素标准品（纯度≥98%）购于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05 mg/mL备用。去离子水。 1.2仪器设备 荧光分光光度计为日本Hitachi公司生产的FL-2700型号；高效液相色谱仪为戴安中国有限公司生产的Dionex P680型，反相C18柱250×4.6mm。 1.3 标样及样品的制备 精确称取芦丁标样0.01 g，色谱级甲醇溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的标准溶液。取标准溶液1、2、3、4和5mL，各加入10%的Al(NO3)3及2.5 mL的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用纯甲醇定容至25 mL。精确称取烘干的银杏愈伤组 织和样品1 g，按固液比1:9加入甲醇，500 W超声波辅助萃取50 min后滤纸过滤，取试样加10%的Al(NO3)3溶液及2.5 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用甲醇定容。 1.4测试条件 荧光分光光度法测定中激发光谱通带和发射光谱通带均设定为5 nm，激发电压700 V，此条件下,扫描最佳激发波长和发射波长，考察铝离子添加量、缓冲液pH、甲醇浓度、反应时间对荧光强度的影响。并在所得的最佳色谱条件下测定各浓度标准溶液的荧光强度，建立回归方程。在相同条件下测定悬浮培养细胞黄酮提取液的荧光强度，根据回归方程计算含量。黄酮糖苷水解及HPLC法测试条件参照Chen等的方法［11］。 1.5 数据处理 所有实验数据利用软件Origin pro 8.0处理。 2 结果与讨论 2.1 最佳激发波长与发射波长的确定 对芦丁标准品进行激发波长和发射波长扫描，如图1所示当荧光强度最大时，激发波长λex=400 nm，发射波长λem=520 nm，所以选择激发波长λex=400nm，发射波长λem=520nm检测黄酮。
图片1 激发波长和发射波长下的扫描 2.2 Al(NO3)3的添加量 考察了10% Al（NO3）3添加量分别为0、1、2、3、4、5和6 mL与黄酮形成的螯合物荧光强度的影响。光谱图如下2所示：
300400500600700800-10010203040506070Intensity
λ/nm
a
300400500600700800-2024681012141618202224262830
32
Intensity
λ/nm
b
050010001500200025003000500550600650700750800a
Intensity
Time/s0500100015002000250030003500450500550600
650700750b
Intensity
Time/s050010001500200025003000450500
550
c
Intensity
Time/s (a)1mLAl3 + (b)2mLAl3+ (c)3mLAl3+ (d)4mLAl3+ (e)5mLAl3+ (f)6mLAl3+
(ck)未添加Al3+ 图2 不同Al3+添加量下芦丁荧光光谱图 结果表明，不添加Al3+的处理中，芦丁未形成螯合物，所以荧光强度一直不
稳定。所有添加Al3+的处理中，在1500 s后基本呈稳定趋势，添加量小于4 mL的各处理其荧光强度在稳定趋势中还有小幅度波动。综合荧光强度和络合物稳定性两方面因素考虑，选择加入硝酸铝的量为4 mL较适宜。 2.3 甲醇浓度的影响 黄酮类化合物在甲醇中溶解度较好，难溶于水，选择甲醇做为溶剂。分别以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶解芦丁，各处理下荧光强度见下图。
0500100015002000250030003500420430440450460470480490500510d
Intensity
Time/s050010001500200025003000300350400
450
500e
Intensity
Time/s0500100015002000250030003500280300320340
360
380400f
Intensity
Time/s
050010001500200025003000406080100120140ck
Intensity
Time/s
0500100015002000120130140150160a
Intensity
Time/s0100200300400500600700800900100011001200150160
170
180b
Intensity
Time/s0100200300400500600700800900100011001200210220230240250
260
270280290c
Intensity
Time/s