总黄酮测定方法
总黄酮测定
目录
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仪器与试光光度仪，水浴锅，索氏提取器 槐米，芦丁对照品 甲醇，亚硝酸钠溶液，硝酸铝溶液，氢 氧化钠试液，乙醚，试剂均为分析纯
2.溶液的制备
（1）对照品溶液的制备
取芦丁对照品50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加 甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度， 摇匀。精密量取 10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度， 摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)
（3）测定法
取本品粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚 适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲 醇90ml，加热回流至提取液无色，移置100ml量瓶中，用甲 醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇 匀。精密量取10ml，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀 。精密量取 3ml ，置 25ml 量瓶中，加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液 10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置 15分钟，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中 芦丁的重量(μ g)，计算，即得。
（2）标准曲线的制备
精密量取对照品溶液 1ml 、 2ml 、 3ml 、 4ml 、 5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml， 加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置 6 分钟，加 10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化 钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟， 以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在 500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓 度为横坐标，绘制标准曲线。
采用紫外分光光度法测定槐米总黄酮的含量 , 比通过显色反应测定总黄酮含量简便 , 提高了实 验的效率。本法简便、 快速、 选择性好、 线性 范围宽、 重现性好、 能全面反映样品中槐米总 黄酮的含量, 适用于槐米的质量检测和总黄酮测 定, 尤其是生产过程的质量控制。
总黄酮含量测定方法
总黄酮含量测定方法
总黄酮是一类化合物的总和，常用的测定方法有色谱法、光谱法和比色法等。
1. 色谱法：色谱法是一种常用的分离和测定化合物的方法。
常用的色谱方法包括高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）等。
其中，HPLC是最常用的测定总黄酮含量的方法。
它可以将样品中的黄酮分离开，并通过检测器测量它们的浓度。
2. 光谱法：光谱法是利用物质对光的吸收、发射、散射等特性进行测定的方法。
常用的光谱法包括紫外-可见光谱法（UV-Vis）和荧光光谱法等。
这些方法通过测量样品在特定波长下的吸光度或荧光强度来确定总黄酮含量。
3. 比色法：比色法是通过比较样品与标准溶液的颜色差异来测定样品中的化合物含量的方法。
通常使用染色剂与样品中的黄酮发生反应，形成有色产物，并通过比色仪或分光光度计测量吸光度，进而计算总黄酮的含量。
需要注意的是，不同的测定方法可能对不同类型的总黄酮有不同的适用性和灵敏度。
因此，在选择测定方法时，需要考虑样品的特性和实验室的仪器条件，确保能够准确测定总黄酮的含量。
总黄酮
总黄酮（以芦丁计）的检验方法
1、 试剂
1.1聚酰胺粉
1.2芦丁标准溶液：称取5.0mg 芦丁，加甲醇溶解并定容至100ml ，即得50μg/ml 。
1.3乙醇：分析纯
1.4甲醇：分析纯
2、分析步骤
2.1样品处理：称取一定量样品，加乙醇定容至25ml,摇匀后，超声提取20min ，放置，吸取上清液1.0ml ，于蒸发皿中，加1g 聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。
先用20ml 苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄铜定容至25ml 。
此液与波长360nm 测定吸收值。
同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算样品中总黄酮含量。
2.2芦丁标准曲线：
吸取芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 于10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm 检测，求回归方程，计算样品中总黄酮含量。
2、 计算和结果表示：
X=1000M V V A 12
∙∙∙100⨯
X-样品中总黄酮的含量，mg/100g;
A-由标准曲线算得被测液中黄酮量，μg;
M-样品质量，g;
V 1-测定用样品体积，ml ；
V 2-样品定容总体积，ml 。
保健食品 总黄酮测定方法
保健食品总黄酮测定方法
保健食品是指具有保健功能的食品，其中总黄酮是一种常见的保健成分。
总黄酮是指一类具有黄酮骨架结构的化合物，包括黄酮类、异黄酮类、花青素类等多种物质。
总黄酮具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种保健作用，因此被广泛应用于保健食品中。
为了保证保健食品中总黄酮的含量符合标准，需要进行总黄酮测定。
总黄酮测定方法主要有两种：分光光度法和高效液相色谱法。
其中，分光光度法是一种简单、快速、经济的测定方法，适用于大批量样品的测定。
该方法的原理是利用总黄酮与铝离子形成络合物，使样品溶液的吸光度增加，从而测定总黄酮的含量。
该方法的操作简单，但对样品的前处理要求较高，需要去除干扰物质，否则会影响测定结果的准确性。
高效液相色谱法是一种准确、灵敏、选择性好的测定方法，适用于复杂样品的测定。
该方法的原理是利用高效液相色谱仪对样品中的总黄酮进行分离和检测。
该方法的优点是测定结果准确可靠，但需要较长的分析时间和较高的仪器成本。
总黄酮测定方法的选择应根据实际情况进行，以保证测定结果的准确性和可靠性。
同时，保健食品生产企业应严格按照国家标准进行总黄酮含量的测定，确保产品质量符合标准，保障消费者的健康。
总黄酮测定含量
1 各批次药材含量测定使用已经确定的总黄酮含量检测方法分别进行5个批次原料含量的测定总黄酮含量测定：分别精密称取药材粗粉0.5g，置100ml锥形瓶中，加70%乙醇50ml，称定重量，超声60分钟，放冷，称定，加入70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
精密量取供试品溶液5ml，置10ml比色管中，加 5％亚硝酸钠溶液0.4ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6 分钟，加2mol/L氢氧化钠溶液3ml，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（《中国药典》2010版一部附录Ⅴ B），在504nm 的波长处测定吸收度。
表1 不同批次药材总黄酮含量测定结果批号含量（%）1 2 3 X±S20140516 0.16350.16480.17010.1661±0.003520140516紫外扫描色谱图2 药材总黄酮转移率研究2.1 单个药材转移率研究2.1.1 单个药材的转移率测定同一批次的各药材，分别按照产品生产工艺提取得单个药材的总黄酮浓缩液样品，进行总黄酮含量检测，与“1”项下同批药材的总黄酮含量相比得出单个药材的转移率（如下式），分别进行5批次药材测定。
黄芪、桑叶、黄精、山茱萸：分别取黄芪、桑叶、黄精、山茱萸各100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水12倍量，煎煮2.0h，过滤；第二次加水10倍量，煎煮1.0h，过滤，合并滤液浓缩至100ml，备用。
黄芪不同浓缩程度的考查：取黄芪100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水20倍量，煎煮2.5h，过滤；第二次加水20倍量，煎煮2.0h，过滤，合并滤液，重复试验三次，分别浓缩至50ml、100ml、200ml，备用。
精密量取上述溶液5ml，加乙醇15ml，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
总黄酮含量测定方案
总黄酮含量测定一样品溶液的制备70%乙醇溶液，料液比1﹕8 ，80度下回流2h。
取10g样品放入圆底烧瓶中加入80ml 70%乙醇溶液回流2h,抽滤定容至100ml备用。
使用时先离心再用70%乙醇稀释10倍做样品溶液。
二芦丁标准品的配置精密称取芦丁2mg，加无水乙醇定容至10ml。
制得浓度为0.2mg/ml芦丁标准品溶液。
三显色方法的确定1 扫描原液分别取芦丁溶液和样品溶液各1ml，加无水乙醇定容至25ml，空白对照，全波扫描。
2硝酸铝显色法分别取芦丁对照品溶液和样品溶液各5ml，加5%亚硝酸钠溶液（1.25g亚硝酸溶于无水乙醇中定容到25ml容量瓶中) 1ml, 摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液(4,4014g硝酸铝.九水溶于无水乙醇中定容到25ml 容量瓶中) 1ml，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠试液(2g氢氧化钠溶于无水乙醇中定容到50ml容量瓶中）10ml, 再加无水乙醇定容至25ml，摇匀，放置15min，空白对照，全波扫描bb 。
3氯化铝显色法分别取芦丁对照溶液和样品溶液各5ml ,加1%的氯化铝溶液（1g氯化铝溶于无水乙醇中定容到100ml容量瓶中)10ml，摇匀放置10min，空白对照，全波扫描。
4 氢氧化钾显色法分别取芦丁对照品溶液和样品溶液各5ml，加3ml10%氢氧化钾溶液（2.5g氢氧化钾溶于无水乙醇中定容到25ml容量瓶中），充分摇匀显色5min后，用无水乙醇定容至25ml, 摇匀，空白对照，全波扫描。
四显色条件的确定五标准曲线的绘制分别取1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6ml芦丁对照品溶液，按所选的显色方法测定吸光度，绘制标准曲线。
六精密度实验按标准曲线绘制方法，分别准确量取1.0ml芦丁标准液5份，按所选显色剂和所确定的最优显色条件在所选波长下测定吸光度。
次数 1 2 3 4 5吸光度平均值相对标准偏差RSD（%）七重现性实验取火棘果样品5份各10g,按提取步骤制得样品液，按制备标准曲线方法显色后测定吸光度值并计算总黄酮含量。
总黄酮的测定方法
总黄酮的测定方法黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,种类繁多, 大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷,部分为游离态或与鞣质结合存在。
黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物, 一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构。
近年来, 黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐, 人们对含有黄酮的化合物进行大量研究, 以期获得黄酮含量较高的中草药。
因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。
一、方法（一）高效液相色谱法1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂（1）高效液相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液3. 操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；流速：lml／min；柱温：40℃；检测波长：360nm；灵敏度：0.02AUFS；进样量：20ul。
食品中总黄酮的测定
实验九食品中总黄酮的测定（－）目的意义黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。
其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。
通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。
（二）高效液相色谱法1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂（1）高效液相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液。
3. 操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；流速：lml／min；柱温：40℃；检测波长：360nm；灵敏度：0.02AUFS；进样量：20ul。
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总黄酮测定（紫外分光光度法，以柚皮苷计）[26]
1）标准曲线
精密称取柚皮苷对照品10mg ，以无水乙醇溶解并定容至50mL ，得0.2mg/mL 柚皮苷溶液。
分别取此浓度0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL ，以无水乙醇定容至5mL ，在284nm 处测定吸光度。
从图1-2中，得回归方程：A=0.0067c-0.0033，R 2=0.9993（n=3）。
式中：c —测定用样品液中的总黄酮含量，μg
A —吸光度
图1-2 总黄酮标准曲线
Fig.1-2 The calibrate curve of flavonoids
2） 样品中总黄酮含量的测定
准确称取试样，以乙醇溶解定容，按标准曲线方法测定[26]。
样品中总黄酮提取率计算公式为：
10010
V m K V c %)P(621⨯⨯⨯⨯⨯= 式中：p: 样品中总黄酮提取率，%;
c ：从标准回归曲线中计算得到的样液的总黄酮含量，μg;
V 1：样品提取液总体积，mL ；
V 2: 测定用体积，mL ；
K ：稀释倍数;
m: 样品的投料量，g。