条纹斑竹鲨IRF_1基因的克隆和特征分析
斑马鱼PKR剪接异构体克隆、鉴定及转录表达分析
欧湘滢等斑马鱼PKR 剪接异构体克隆、鉴定及转录表达分析第7期斑马鱼PKR 剪接异构体克隆、鉴定及转录表达分析①欧湘滢邵敏高宗泽代卫凯熊嘉鸿胡有生（井冈山大学医学部，吉安343009）中图分类号R392.12文献标志码A文章编号1000-484X （2021）07-0839-06［摘要］目的：克隆斑马鱼PKR （ZPKR ）及其剪接异构体（ZPKRV ）并对其进行鉴定和转录表达分析。
方法：采用基因克隆法克隆ZPKR 及ZPKRV ；利用生物信息学方法分析其结构差异，设计定量分析引物；使用病毒双链RNA 类似物（Poly I ：C ）刺激，提取斑马鱼组织总RNA 并反转录合成cDNA ，通过qPCR 检测ZPKR 及ZPKRV 转录表达的差异，推测ZPKR 及ZPKRV 的功能。
结果：首次在斑马鱼组织中克隆到ZPKRV ；生物信息分析显示，ZPKRV 仅仅在ZPKR 的双链RNA 结合结构域和激酶区之间的链接区缺失了28个氨基酸残基，并且缺失的序列包括链接区的碱性区；Poly I ：C 刺激后的转录表达显示，在刺激后的12h ，ZPKR 表达上调到第一个峰值，24h 又下调，48h 再上调；而ZPKRV 仅在刺激后24h 表达上调到最高，然后下调。
结论：ZPKRV 碱性区的缺失，可能会导致其单链RNA 结合功能的丧失，进而促进蛋白的翻译表达；ZPKR 和ZPKRV 同时表达，可能通过显性的负效应，降低PKR 在抗病毒免疫反应中对蛋白翻译的抑制作用，促进抗病毒免疫细胞因子的翻译表达。
［关键词］斑马鱼；ZPKR ；ZPKR 剪接异构体；转录表达Cloning ，identification and transcription analysis of PKR transcript variant from ZebrafishOU Xiang -Ying ，SHAO Min ，GAO Zong -Ze ，DAI Wei -Kai ，XIONG Jia -Hong ，HU You -Sheng.Department of Medi⁃cine ，Jinggangshan University ，Ji′an 343009，China［Abstract ］Objective ：To clone the Zebrafish PKR （ZPKR ）and ZPKR transcript variant （ZPKRV ），then analyze its transcrip‐tional expression.Methods ：ZPKR and ZPKRV were cloned by gene cloning method.Bioinformatics approaches were used to analyzethe structural differences and design primers for quantification it.Furthermore ，Zebrafish were stimulated with Poly I ：C and the total RNA were extracted for reverse transcription.Then fluorescence qPCR was utilized to detect the difference in the transcriptional ex‐pression of ZPKR and ZPKRV ，and to speculate on their function.Results ：It was the first time that the ZPKRV was cloned in Zebraf‐ish tissue.Bioinformatics analysis revealed that compared with ZPKR ，ZPKRV was only deleted 28amino acid residues in the linker between dsRBD and KD ，including the conserved basic region in the linker.After Poly I ：C stimulation ，the transcriptional expressionof ZPKR was up -regulated to the first peak at 12h and then down -regulated at 24h ，again it was up -regulated at 48h.However ，ZP‐KRV was only up -regulated at 24h ，and it was down -regulated subsequently.Conclusion ：The deletion of the basic region in the Ze‐brafish PKRV may result in the loss of its single -stranded RNA binding function ，which in turn promotes protein translation.ZPKR and ZPKRV coexisted in Zebrafish may reduce the inhibitory effect of PKR on protein translation in the antiviral immune response and enhance the translation of antiviral immune cytokines through dominant -negative effect.［Key words ］Zebrafish ；ZPKR ；ZPKR transcript variant ；Transcriptional expression非特异免疫是脊椎动物抵抗病毒侵入的第一道防线，干扰素系统则是机体非特异免疫抵抗感染和清除病毒的主要功能分子体系，而斑马鱼PKR（zebrafish double -stranded RNA -dependent protein ki‐nase ，ZPKR ）是干扰素系统抗病毒作用的主要效应分子［1-6］。
青石斑鱼MHCclassI基因的克隆与分析
【国家自然科学基金】_硬骨鱼_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
2011年 科研热词 基因结构 圆斑星鲽 组织特性表达 系统发育 硬骨鱼 多态性 分类 mhc ⅱb cdna 鲹鱼宗系 鲷科 鲟鱼 雄激素受体 金线鱼属 配体亲和力 线粒体dna 系统进化 粘膜免疫 生长 生殖 性别分化 孕酮受体 基因克隆与表达 军曹鱼 内分泌激素 免疫细胞化学 免疫球蛋白 中国海 中华乌塘鳢:嗅觉系统 mhcⅰα igt 推荐指数 3 3 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 科研热词 推荐指数 序号 鱼类 3 1 生物胞素 3 2 趋化性 2 3 表达 2 4 血清 2 5 粘液 2 6 基因表达 2 7 刺激隐核虫 2 8 克隆 2 9 中草药 2 10 黏膜免疫 1 11 鲤科 1 12 鲁氏耶尔森氏菌 1 13 鱼鳞 1 鱼类微体化石 1 鱼牙 1 青鳉:性腺分化与发育:性逆转:石蜡切片:组织学观察 1 长pcr 1 鄂西 1 西伯利亚鲟 1 药敏特性 1 脂蛋白脂肪酶 1 胸鳍 1 肝损伤 1 缺氧环境 1 结构域混编 1 组织表达 1 线粒体基因组 1 眼睛 1 病毒感染 1 牙鲆 1 滑车神经 1 海洋动物 1 棒花鱼 1 斜带石斑鱼 1 干扰素调节因子(irf)4 1 孤峰组 1 大菱鲆 1 大口黑鲈 1 多聚免疫球蛋白受体(pigr) 1 多态性 1 基因结构 1 基因同源性 1 基因分化 1 动眼神经 1 分化 1 信号通路 1 保守 1 中二叠统 1 上升流 1 三叉神经运动核 1 ⅱ型干扰素 1
斑马鱼
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1、用于细胞谱系分析 2、用于研究突变对胚胎的影响
3、用于饱和诱变，克隆和分析造成突变的原因
4、基因转移
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1、细胞谱系分析
含义：通过记录特定细胞在胚胎发育中的分裂历史，来揭 示其特定的细胞发育命运，观察发育潜能。 方法：直接观察法、遗传嵌合克隆分析法、颜料示踪分析 法
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2、突变
原理：斑马鱼单倍体和二倍体雌核发育 方法：①单倍体胚胎培育： 精子（经紫外照射）＋卵子
②二倍体胚胎培育
精子（经紫外照射）＋卵子
静水压休 克或热休 克e 9
作用及特点： 单倍体胚胎：胚胎可发育成基本体型 表现多种畸形 受精4天左右死亡 可用来甄别影响基本体型的突变 二倍体胚胎：可存活且可育 隐形突变通过一至三代繁育 可鉴定出来
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3、饱和诱变
原理：
化学诱导剂
成熟的精子 ＋卵子
三代繁育
发育异常胚胎 筛选
发育通道由一系列的分子事件控制，要想解 析完整的发育过程，需要掌握控制每一系列 事件的全部基因或几乎所有基因 所以，需要大量的动物个体才可进行筛选
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选择斑马鱼的优势： ①发育快、繁殖能力强 ②卵子体外受精、胚胎体外发育
斑马鱼的个“鱼”简历
• 斑马鱼（zebra fish）(拉丁名：Danio rerio)
中文学名： 斑马鱼 蓝条鱼、花条鱼、 蓝斑马鱼、印度 鱼、印度斑马鱼 Danio rerio 动物界 脊索动物门 Chordata 科： 纲： 辐鳍鱼纲 Actinoptery gii 鲤形目 Cyprinifor mes 鲤科 Cyprinidae （鱼丹）属 Danio 斑马鱼 D.
——在胚胎期产生的突变体也可呈现出 研究范围
斑马鱼在基因谱系发育上的模式动物地位探究
斑马鱼在基因谱系发育上的模式动物地位探究斑马鱼（Danio rerio）作为一种受欢迎的实验动物模型，在基因谱系发育研究中扮演着重要的角色。
其独特的特征和生命周期使其成为理想的研究对象，能够揭示许多关于基因在发育和疾病中的功能和调控的重要问题。
本文将探讨斑马鱼在基因谱系发育上的模式动物地位，并介绍其在这一领域内的应用。
斑马鱼作为一种小型鱼类，具有许多独特的特征，使其成为研究基因谱系发育的理想模式动物之一。
首先，斑马鱼的生命周期相对短暂，从受精到成熟只需大约三个月的时间。
这使得研究者可以在相对较短的时间内观察和分析整个发育过程中基因的表达和功能变化。
此外，斑马鱼的胚胎发育非常透明，研究者可以轻松观察到内部器官和组织的形成，从而洞察基因的作用和调控。
这种深入了解的程度为研究者提供了独特的机会，使其能够研究和解释一系列与发育相关的问题。
斑马鱼的基因组也是研究者们青睐的因素之一。
斑马鱼基因组中包含约2.7亿个碱基对，大约有2.5万个基因，与人类基因组的相似之处较多。
这表明斑马鱼的基因调控机制可能与人类的相似，研究斑马鱼能够进一步增进我们对基因功能和调控的理解。
此外，斑马鱼的遗传工具和研究工作具有广泛的可行性，有利于开展基因谱系发育的实验研究。
在基因谱系发育的研究中，斑马鱼被广泛应用于多个领域。
首先，斑马鱼被用于研究胚胎发育和器官形成过程中的基因调控。
通过观察和调控斑马鱼胚胎发育的不同阶段，研究者们能够揭示基因在整个发育过程中的功能和调控机制。
例如，他们可以利用斑马鱼模型研究心脏、肌肉和神经系统的形成，并阐明这些器官发育过程中关键基因的功能。
其次，斑马鱼也被广泛用于研究遗传突变和疾病模型。
斑马鱼的遗传工具和便捷的实验操作使其成为研究遗传突变和疾病模型的理想选择。
研究者们可以通过诱变斑马鱼基因来模拟人类疾病，从而研究该疾病的发病机制和潜在治疗方法。
例如，斑马鱼模型已经成功地用于研究心脏病、肿瘤、神经发育异常等多种疾病。
转基因鱼的构建及检测
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万方数据
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农业生物技术学报
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基因开始的。首例报道的转基因鱼是导入人生长激 !"#$$$获$得目的基因
素（ #$%）基因，启动子是 &’()*&#道不断增加 ， ),-./"+ 有的导入牛生长激素基因 合适的目的基因。侧翼调控序列包括位于基因编码
步筛选出整合了外源基因的实验鱼；再用 12345678 杂交法确认真正整合的转基因鱼；最后采用 $27459 678 杂交法证实转录 :0$% 的鱼，并用放射免疫法 确定其表达情况。 %"&$$整$ 合了外源基因受体鱼的筛选
从注射了外源基因的受体鱼中筛选出整合了外 源基因的鱼，为以后进一步检测外源基因的整合和 表达缩小检测鱼的数量。具体操作如下：
用常规微量注射法注入金鱼受精卵内，获得转抗冻 以上外源基因拷贝的外源生长激素基因。显微注射
蛋白基因金鱼。但从目前的研究来看，转基因鱼中 后，受体卵在 %14J5H:J:H 溶液中发育，胚胎发育至原
BCD 的量还不足以产生抗冻的效果，因此在今后的 肠期后，将培养液逐渐用曝气的冷开水稀释，直至心
研究中要提高启动子的增强效应，或者增加基因导 跳期之后胚胎完全在曝过气的冷开水中培育成鱼
农业生物技术学报 C,D1-793,>3EF18/D90D1793G8,0./H-,9,FI3333?@@?J%$3（3 B）： ’$(K’%%
转基因鱼的构建及检测 L
杨 弘 吴婷婷 夏德全 LL
（ 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡 ?%B$M%）
33·3 专家论坛·
摘 要 ：转 基 因 鱼 技 术 是 鱼 类 育 种 的 重 要 方 法 之 一 。 介 绍 了 外 源 基 因 的 克 隆 、转 基 因 鱼 的 构 建 及 其 检 测 ，并 指 出 在 进 行 鱼 类 转基因研究中需注意的一些问题：克隆合适的启动子是保证外源基因在转基因鱼中有效表达的重要因素；构建“ 全鱼”基因则 是今后发展的方向，受到越来越多的关注；显微操作技术仍是构建转基因鱼的主要方 法 ；在 转 基 因 鱼 的 检 测 中 ，应 注 意 转 基 因 嵌合体的问题。
鲨鱼的骨骼进化.总结
鲨鱼骨骼的进化研究（华南师范大学生命科学学院，广东广州）纲要：鲨鱼作为大海里最凶狠的大海生物之一，其进化充满了奇特色彩。
鲨鱼从始到今其骨骼发生了怎么样的进化，其骨骼的进化历程是怎么样的，鲨鱼骨骼的进化对其更好适应大海产生怎么样的影响，这些研究能让我们更好的认识和认识鲨鱼。
重点词：鲨鱼骨骼进化The evolution of the shark bone(South China normal university.School of life science, Guangzhou guangdong)Abstract: Shark, as one of the most fierce sea creatures in the sea, its evolution is full of magical color. Sharks from the beginning to today the evolution of its bones what happened, what is the evolution of the bone, the evolution of the shark bone how influence on its better adapt to the ocean, the study can make us better understand and meet the shark. Keywords: shark bone evolution一、鲨鱼的分类地点及特色鲨鱼（ Selachimorpha），动物界，脊索动物门，鱼纲，软骨鱼类，板腮鱼亚纲，鲨总目，鲨总当今分 8 个目。
鲨鱼是一群板鳃类鱼的通称，这是一类古老的鱼种，在侏罗纪时已经形成现代种类的鲨鱼，鲨鱼身体无鳞，鳃裂有 5 至 7 对，散布在世界各地温带和热带的大海，是海洋中最凶狠的鱼类之一。
[1]二、鲨鱼进化历程中鱼类骨骼特色图一地质年月表 [2]奥陶纪上泥盆纪中泥盆纪棘鱼类盾皮鱼类裂口鲨现代鲨鱼1. 棘鱼类 (Acanthodii)及其骨骼特色棘鱼类是最早出现的原始又颌鱼类，可能出此刻奥陶纪，最早的化石发此刻大概 4.5 亿年前的地层中，茂盛于志留纪和泥盆纪，于 3 亿年前的石炭纪灭绝（梯棘鱼为棘鱼类的代表）。
法医物证学重点
法医物证学重点第一章绪论法医物证学：法医物证学是应用多种学科的理论知识和技术研究并解决涉及法律方面有关生物性检材的检验与鉴定的一门学科。
应用的学科包括：医学、生物学、遗传学、免疫学、血型血清学、生物化学及分子生物学等。
法医物证学：是以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科。
法医物证学是法医学的分支学科，其研究内容属于法医学中的物证检验部分，是法医学研究的主要内容之一。
法医物证是一门应用科学，研究的方法涉及多种学科包括：①化学，②物理学，③电子计算机，④形态学，⑤免疫血清学，⑥生物化学，⑦分子生物学，⑧遗传学等方法。
法医物证的特点：①法医物证的稳定性受环境条件的影响；②法医物证属于“科学证据”。
第二章法医物证分析的遗传学基础1、何谓遗传标记？个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就成为遗传标记GM。
2、何谓基因、基因型和表型？1)基因型：是指个体一个或多个基因座上等位基因的组合，是生物体可见性状的实际基因组成。
2)表型：是指生物体某特定基因所表现的性状。
表型由基因型决定。
3、Hardy-Weinberg平衡定律的前提条件和意义1)前提条件：群体无限大、随机婚配、没有突变、没有大规模的迁移和没有选择因素的影响。
2)结论：群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变。
3)意义：4)反映基因频率和基因型频率的关系（纯合子基因型频率=基因频率的平方，杂合子=该两基因7)高多态性1)遗传规律：共显性2)个体组织同一性：一致3)群体遗传学特征：4)高突变率：配子细胞形成时重排、重组、交换1、何谓扩增片段长度多态性分析？Amp-FLR：采用PCR技术扩增VNTR或STR 基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。
2、RFLP与Amp-FLP技术有何异同？（P74）3、STR分型用于法医物证鉴定的主要优点？1)高灵敏度：适用于微量降解检材2)高鉴别能力：节约检材、试剂和提高效率3)标准化分型：实现数字化结果，利于实验室间数据交换，建立数据库4、何谓miniSTR？miniSTR分型有何法医学应用价值？1)miniSTR：通过重新设计引物，使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列，从而降低扩增产物的大小，进一步提高灵敏度和分型成功率，这种技术称为短片段STR分型或miniSTR分型。
(完整版)斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的克隆及生物信息学分析
园艺学报 2010，37（10）：1575–1582Acta Horticulturae Sinica梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的克隆及生物信息学分析李节法，田义轲*，王彩虹，田伟，宋伟，殷豪（青岛农业大学园林园艺学院，山东青岛 266109）摘 要：以黄金梨（Pyrus pyrifolia Nakai）茎尖为试材，应用同源克隆和RACE方法从梨茎尖中克隆到赤霉素合成代谢的关键酶：内根-贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA的全长序列，命名为PpKO，GenBank登录号为：HM003112，其长度为1 752 bp。
PpKO的开放阅读框（ORF）编码515个氨基酸，相对分子量为59.007 kD，等电点为7.19。
氨基酸同源性分析表明，PpKO与已报道的其它植物的KO氨基酸序列具有59.4% ~ 95.9%相似性；氨基酸聚类分析表明，梨和苹果首先聚类，其次是草莓；生物信息学分析表明：PpKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。
关键词：梨；贝壳杉烯氧化酶基因（PpKO）；生物信息学分析中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）10-1575-08Cloning and Bioinformatics Analysis of ent-Kaurene Oxidase Gene PpKO in Pear（Pyrus pyrifolia Nakai）LI Jie-fa，TIAN Yi-ke*，WANG Cai-hong，TIAN Wei，SONG Wei，and YIN Hao（College of Landscape and Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）Abstract：Ent-kaurene oxidase（KO）is a critical enzyme in the pathway of gibberellins biosynthesis. In this research，ent-kaurene oxidase gene in pear，designated as PpKO（GenBank accession number：HM003112），was isolated from‘Whangkeumbae’（Pyrus pyrifolia Nakai）stem apical tissue by homologous cloning and RACE technology. The full cDNA was 1 752 bp in length with an open reading frame（ORF）of 1 548 bp encoding a protein of 515 amino acids. Molecular weight and isoelectric point of the protein was 59.007 kD and 7.19，respectively. Amino acids homology analysis indicated that the sequence had 59.4%–95.9% similarity with those of other reported plants. Amino acids cluster analysis showed that KO from apple was clustered together with PpKO firstly，and followed by that from strawberry. Bioinformatics analysis exhibited that PpKO contained a core functional domain of cytochrome P450（FXXGXRXCXG）and transmembrane region near the N-terminus.Key words：pear；ent-kaurene oxidase gene（PpKO）；bioinformatics analysis果树的矮化性状是一个非常重要的农艺性状，在提高产量、改进品质和变革果树种植模式上发收稿日期：2010–06–02；修回日期：2010–09–03基金项目：山东省自然科学基金项目（Y2008D51）；青岛农业大学高层次人才科研基金项目* 通信作者Author for correspondence（E-mail：yktian123@）1576 园艺学报37卷挥着巨大作用。
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第35卷 第1期 水生生物学报 Vol. 35, No.1 2011年1月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Jan., 2 0 1 1
收稿日期: 2009-05-19; 修订日期: 2010-01-02 基金项目: 国家973计划(HCV2009CB522500)资助 作者简介: 甘小妮(1964—), 女, 四川人; 在读博士; 主要从事分子生物学方面研究。E-mail: ganxn@ihb.ac.cn 通讯作者: 陈新文, E-mail: chenxw@whiov.ac.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00194 条纹斑竹鲨IRF-1基因的克隆和特征分析 甘小妮1,2 陈新文1 (1. 中国科学院武汉病毒研究所, 武汉 430072; 2. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072)
CLONING AND CHARACTER ANALYSES OF IRF-1 GENE OF CHILOSCYLLIUM PLAGIOSUM GAN Xiao-Ni 1,2 and CHEN Xin-Wen1 (1. Institute of Wuhan Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072)
关键词: IRF-1; 条纹斑竹鲨; 克隆; 特征分析 Key words: IRF-1; Chiloscyllium plagiosum; Cloning; Character analyses 中图分类号: Q781 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2011)01-0194-03
鱼类中IRF-1基因的克隆测序目前仅局限于辐鳍鱼类[1,2], 而在软骨鱼类中未见报道。IRF-1是干扰素调节因子家族的成员之一[3]。除作为干扰素的转录调节因子外[4], 还具有其他功能[5—10]。作为天然免疫重要的调节因子其基因在哺乳类中得到了广泛的克隆和分析。IRF-1与其他家族成员一样, 在氨基末端前115个氨基酸都具较高同源性, 具有色氨酸重复特征且包围在DNA绑定域周围。而在蛋白质羧基末端区域的序列更具多变性。除 IRF-1和IRF-2以外, 所有干扰素家族成员都有IRF结合域(IAD), 有赖于此家族成员或转录因子与其他因子之间相互作用。然而IRF-1和IRF-2包含了不同的结合域(IAD2), IAD2主要与IRF-8发生相互作用[11,12]。比较进化不同阶段特别是原始物种的IRF-1基因序列有助于我们了解其进化过程。板鳃类即软骨鱼类是脊椎动物进化过程中的重要环节。为了解低等脊椎动物中IRF基因的结构和特征, 我们通过简并引物扩增IRF-1基因的保守片段, 然后RACE克隆测序获得条纹斑竹鲨IRF-1基因的全长。目前鱼类中的IRF家族基因测序仅在硬骨鱼中有零星报道, 且局限于少数种类, 例如仅在鳜鱼中的IRF-1, 乌鳢中的IRF-1、IRF-2和IRF-7, 河豚[13](Fugu rubripes)和日本鲽鱼[14] (Paralichthys olivaceus)中的IRF-1, 鲫鱼的IRF-7的相似
序列[15]被克隆测序。然而鱼类中IRFs方面的知识与哺乳动物的相比还非常有限。该研究首次报道了软骨鱼类中IRF-1基因序列, 填补了软骨鱼类中IRF基因研究的 空白。
1 材料与方法
1.1 标本采集和鉴定 条纹斑竹鲨的标本购自武汉水产市场, 标本的鉴定在中国科学院水生生物研究所水生生物博物馆进行。 1.2 总RNA提取和RACE克隆测序 条纹斑竹鲨总RNA从肾、脾、肝、肠、鳃组织中提取。使用Trizol试剂盒(Invitrogen, USA)。第一链cDNA合成使用逆转录M-MLV试剂盒(Invitrogen, USA)。IRF-2基因cDNA序列保守区简并引物的设计是在比对所有已知IRF-1基因cDNA序列后完成的。正向引物: (5′-CARATHCCNTGGATGCAYGC-3′); 反向引物: (5′-GCYTTCCAKGTYTTNGGRTC-3′)。PCR反应的总体积为50 μL, 其中含100 ng cDNA, 10×缓冲液5 μL (Ta-1期 甘小妮等: 条纹斑竹鲨IRF-1基因的克隆和特征分析 195 KaRa大连), 引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTPs (每种浓度为2.5 μmol/L) (TaKaRa大连) 2 μL, Taq聚合酶(TaKaRa大连)2.0 U, 最后补足灭菌双蒸水至终体积。PCR反应条件为94℃预变性3min; 94℃变性30s, 52℃退火温度30s, 72℃延伸30s, 35个循环, 最后终延伸温度72℃ 7min。为了得到全长cDNA序列, 克隆IRF-2基因cDNA序列使用cDNA末端快速扩增试剂盒(Ambion 公司FirstChioce RLM-RACE Kit (Cat # AM1700) )。使用特异引物和接头引物。5′RACE外引物: GCTTTCCACGTATTCGGTTCTGG; 5′RACE内引物: AGGCTTGCATCAGTGTCCATGTTC; 3′RACE外引物: GACATGGATGGAACATGGACACTG; 3′RACE内引物: GCAAGCCTTTTCAGAAACTGGGCT。PCR反应条件为94℃预变性3min; 94℃变性30s, 62℃退火温度30s, 72℃延伸1min40s, 35个循环; 最后终延伸温度72℃ 7min。扩增产物经1.2%的琼脂糖(RACE为2%)凝胶电泳后, 用DNA凝胶回收试剂盒(Omega公司)进行割胶回收, 回收的目的片段用pMD18-T vector 试剂盒(TaKaRa) 为载体进行连接, 以DH5α作为宿主菌、进行转化和克隆, 对所得到的克隆进行测序, 引物采用M13通用测序引物。
1.3 序列比对 序列比对使用clustal X, 参数设置使用缺省值。序列编辑使用BioEdit和SEAVIEW。蛋白质翻译使用Mega 4.1。
2 结果与讨论
克隆测序结果显示条纹斑竹鲨IRF-1基因cDNA 全长为1655 bp (Genbank登录号为HM044308), 完整的开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸。终止密码子为TAA。 5′非编码区(UTR)为88 bp, 3′非编码区(UTR) 546 bp。与已知辐鳍鱼类IRF-1基因序列比对后, 我们发现它的前345 bp序列具有较高的同源性(图 1)。而其余部分呈现较高的变异度。翻译后的氨基酸序列比对结果显示更高的同源性, 特别是前115氨基酸所构成的DNA绑定域(DBD)。序列中色氨酸重复特征非常明显, 与其余种类的高度一致。我们还在氨基酸序列中辨别出c端含反式激活区(Transactivating region)和IRF结合域2(IAD2)。
图1 条纹斑竹鲨与几种脊椎动物IRF-1多序列比对 Fig. 1 Multiple sequence alignment of IRF-1 gene among Chiloscyllium plagiosum and several kinds of vertebrate 196 水生生物学报 35卷 参考文献: [1] Sun B, Chang M, Chen D, et al. Gene structure and tran-scription of IRF-2 in the mandarin fish Siniperca chuatsi with the finding of alternative transcripts and microsatellite in the coding region [J]. Immunogenetics, 2006, 58: 774—784 [2] Jia W, Guo Q. Gene structures and promoter characteristics of interferon regulatory factor 1 (IRF-1), IRF-2 and IRF-7 from snakehead Channa argus [J]. Molecular Immunology, 2008, 45: 1419—1428 [3] Mamane Y, Heylbroeck C, Genin P, et al. Interferon regula-tory factors: the next generation [J]. Gene, 1999, 237: 1—14 [4] Barnes B, Lubyova B, Pitha P M. On the role of IRF in host defense [J]. Journal of Interferon Cytokine Research, 2002, 22: 59—71 [5] Vaughan P S, Azia F, Van Wijnen A J, et al. Activation of a cell cycle regulated histone gene by the oncogenic transcrip-tion factor IRF-2 [J]. Nature, 1995, 377: 362—365 [6] Luo W, Skalnik D G. Interferon regulatory factor-2 directs transcription from the gp91phox promoter [J]. Journal of Biological Chemistry, 1996, 271: 23445—23451 [7] Jesse T L, LaChance R, Iademarco M F, et al. Interferon regulatory factor-2 is a transcriptional activator in muscle where it regulates expression of vascular cell adhesion molecular [J]. Journal of Cell Biology, 1998, 140: 1265—1276 [8] Xi H, Blanck G. The IRF-2 DNA binding domain facilitates