实验一微生物拮抗作用文档

《生物技术大实验》讲义

实验一枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用

实验目的：进一步掌握无菌操作技术，加深对微生物之间互作的进一步认识

实验原理：枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长

供试菌株(1) 拮抗菌株: 枯草芽孢杆菌（冰箱保存）

(2) 病原菌株: 棉花黄萎病菌（冰箱保存）

实验步骤

1. 培养基的制作

(1)PD培养液：(2) PDA培养基：查氏培养液：按上述配方配制查氏液体50 ml及固体胶培养基

125 ml分别装在250的三角瓶中，121℃条件下灭菌30分钟。

2. 接种培养

(1) 在无菌操作条件下，将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中，28℃振荡培养4天。

(2) 将枯草芽孢杆菌在PD培养液中28℃培养24小时

3. 抑菌试验

(1) 平板制备：将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中，制成平板

(2) 棉花黄萎病菌液涂皿：将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上

(3) 枯草芽孢菌的接种：将圆滤纸片放置在平板培养基上，用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸

片上

(4) 培养：28 ℃培养箱中培养4天

(5) 观察结果

实验二酶联免疫法测ABA含量

仪器：酶联免疫仪

酶标板

752分光光度计

实验原理本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。

测定方法

1、包被：在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液，37℃湿盒过夜。

2、标样稀释?：取8支试管每管加150μLDB，第一管中加入50μL（2000ng／50μL）标准液，充分涡

旋后，取50μL至第二号管中，同样涡旋后，取50μL到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng／50μL。

3、洗板：从37℃湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩

干（吸水纸）。

4、加样：1～8孔对应加入ABA标样50μL，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50μLDB，三

排重复；然后每孔加50μL抗体，37℃ 45分钟。

5、洗板：

6、加酶标二抗：每孔加100μL，37℃反应1小时。

7、洗板：

8、显色：各孔加10μLOPD显色液，37℃ 20分钟。

9、终止反应：各孔加50μL 6NH2SO4。

10、读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。

11、结果计算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lg［ABA］）为横

坐标,绘制曲线。

实验三质粒DNA的提取及其酶切

实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 。

实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

实验步骤

（一）提取质粒

1.将2 ml 含相应抗生素的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，

37℃振荡培养过夜。

2.取培养物倒入微量1.5ml离心管中，4000 r/min 离心 2 min。

3.弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4.加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放置10 min。

5.加200 ul溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上 5 min 。

6.加入150 ul 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15 min 。

7.12000 r/min ,离心15 min ，将上清转至另一离心管中。

8.加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000 r/min，离心5 min，将上清转移到另

一离心管中。

9.加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10 min。12000r/min离心 5 min。倒去上清液，

把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10.用1 ml 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11.加50 ul TE缓冲液，其中含有20 ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。

（二）酶切

取DNA溶液，加酶切缓冲液，Eco RI酶1 ul，无菌水补至总体积10 ul，37℃保温3h,加终止液，准备下个实验电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。

实验四琼脂糖凝胶电泳技术

［实验目的］通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

［实验原理］DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几

乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。

[实验步骤]

(一)制备琼脂糖凝胶

电泳槽及用胶量

将琼脂糖按比例溶入1X TAE缓冲液中，微波炉加热至完全溶化，

冷却至60℃, 加入适量EB, 混匀。

（二）胶板的制备

1.取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留

缝隙）。

2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐

3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的

胶面

（注意不要形成气泡）。

4.待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。

5.加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三）加样, 用移液器将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与

电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。

2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。

实验五真核生物高分子量DNA制备

实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

实验材料: 新鲜植物叶片

[实验步骤]

1.取4g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状（越细越好）。

2.转移至50ml离心管中，加入16ml TENbf，充分混匀。65℃水浴保温20min。

3.从水浴中取出离心管，加入5ml 5 mol/L KCl溶液，混匀，水浴20min。

4.4000r/min 离心 20 min。

5.将上清液转移到另一50ml离心管中。

6.加等体积酚／氯仿混匀，12000r／min 离心5min，取上清。

7.加等体积氯仿，混匀，12000r／min 离心5min，取上清。

8.加入0.6－1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。放置时间

9.离心获得沉淀，70％乙醇洗3次。风干沉淀。

10.加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。

11.取3μL上清液,琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。

实验六PCR基因扩增

实验目的：掌握PCR反应的基本原理与实验技术

实验原理：PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链， DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。

1．变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.

2．退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.

3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA.上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

一、仪器、实验用品、试剂

一、仪器

PCR仪冰箱

电泳仪微波炉

电泳槽离心机

紫外检测仪

二、试剂

PCR Buffer TAE(500ml)

Ice 琼脂糖

Tag 溴化乙锭

d NTPs 溴酚蓝

模板DNA marker

Primer1

Primer2 石蜡油

三、其它用品

移液器（一套）Tip（一套）

PCR管 (0.2ml)防护眼镜

一次性手套胶带

四:实验步骤

●时间安排：上午 10：30 配反应体系

中午 PCR

下午电泳

●PCR（范提供）反应体系

10x Bf 1x 2.5ul

Tag 5u/ul 0.2ul

D NTPs 2.5um 2.0ul

Primer1 10um 2.5ul

Primer2 10um 2.5ul

DNA 2.0ul

----------------------------

H2O to 25ul

混匀，加石蜡油

程序：94℃预变性3’

以下35cycle

94℃变性 1.5min

50/55℃退火 30s

72℃延伸 1-2min

最后

72℃ 5min

●电泳配制1％琼脂糖凝胶，取10ul扩增产物电泳分析PCR结果

●bf : KCl 50mmol/L 促进引物退火

Tris.HCl 10-50mmol/L PH 8.4

BSA 100ug/ml （乙酰化的BSA）对酶有保护作用

Mg离子: 1.5-2mmol/L

1.与d NTP 结合（PO4离子）

2.与引物中的 EDTA结合

3.与模板中的 EDTA结合

4. Taq 活性需要游离的Mg离子

●购d NTP 为25um, 需稀释10倍至2.5um

●Primers:

Boo12 F 10D

Boo14 R 10D

分子量 24bp * 324.5 = 7788

质量数 10D ＊ 33 ＝33ug

摩尔数 33 ／7788 ＝4.2 n mol

浓度 4.2 n mol/84ul H2O = 50um

取母液（50um）1ul加水至5ul , 稀释5倍，则终浓度为10um

二、几种常用反应体系：

1.在0.2ml Eppendorf 管内配制25ul反应体系 (华美PCR kit)

安排 4人一组每班可分5组终浓度

10x bf 5 ul (MgCl2-free)

MgCl2 3 25mmol/L 1.5

4dNTPs 4 2.5mmol/L/each 0.2

P1 2 12.5pmol/ul 0.25

P2 2 12.5pmol/ul 0.25

Λ DNA 2 1ng/ul 2 ng

Taq 1 3u/ul

H2O 31

Total 50ul

混匀离心 50ul 石蜡油离心

PCR 程序 94℃ 5min

94℃ 1min

60℃ 1min

72℃ 1min

30 cycle

72℃ 5min

琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制1％琼脂糖凝胶，取10ul扩增产物电泳。

实验七DNA重组技术－酶切、连接

实验原理: DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。

限制性内切酶的一个活性单位U

理论上，1hr,切1ug DNA 样品中所有专一位点的所用酶量

实际反应，1U酶：能完全切割1ul λDNA的一个位点

不能完全切割1ug 带有4个酶切位点的样品和不纯的样品

如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。

限制性内切酶的使用注意事项：

10x bf o 无盐

注意混匀L 低盐

H 高盐

一.仪器

水浴锅(37℃，65℃)凝胶电泳

灭菌锅紫外检测

离心机

二.试剂及溶液

λDNA EcoR I

pUC18 无菌水

终止液(40%蔗糖) 70％，100％酒精

3Mol/L KAc(pH5.2) ice

琼脂糖溴酚蓝

TE TAE

EB marker

三.用品

移液器20ul 一次性手套

tip 20ul 防护镜

离心管0.5ml 吸水纸

胶带浮子

PUC 18/19,λDNA

2人／组，一人做PUC18 酶切（20ug）Takara 25ug/个

一人作λDNA 酶切（15ug）

EcoR1 1ul/人（10 u）(20ul) Takara 4000u/个

四：酶切反应:

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头.

[注意]

1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg λDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。

反应 1. PUC 4ul (0.5ug/ul)

buffer 2ul

EcoR1 1ul 350u/ul(15u/ul)

H2O 15ul

---------------------------

Total 20ul

反应2. λDNA 4ul (1.5ug, 0.4ug/ul)

bf 1

EcoR1 1

H2O 4

----------------------

Total 10ul

●37℃,2hr

●终止反应65℃10min

●各取2ul酶解液，电泳

EcoRI切割λDNA后电泳得到6个片段,

长度分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb

实验八DNA重组技术（二）连接

实验原理：质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接