硕士研究生开题报告02

南开大学攻读硕士学位研究生毕业（学位）论文选题报告评审表硕士生姓名徐良慰学院（系、所）医学院专业名称耳鼻咽喉头颈外科学指导教师杨仕明职称主任医师、教授入学日期 2013 年 09 月南开大学研究生院填表日期 2015 年 6 月 2 日说明1．硕士研究生的毕业（学位）论文对所研究的课题应有新的见解。

其选题应在理论上或应用上有一定的意义或价值。

2．本评审表包括硕士研究生的书面报告和评审意见两方面内容。

书面选题报告由硕士生用A4纸张书写后作为附页，主要内容包括：该选题当前研究状况；硕士研究生本人完成这一课题研究已具备的基本条件；拟在哪些方面有所进展和突破，可能遇到的问题，困难及解决的办法和措施。

3．选题报告由硕士研究生所在的专业、学科点组织3名以上有高级职称的同行进行评审。

硕士生应向评审小组作全面的选题报告，评审小组经认真评审后填写具体评审意见。

选题报告通过后不可随意改题。

确有特殊原因需改题者，须由硕士生本人写出书面报告，经导师和评审小组及学院（系、所）主管领导签署意见批准后，留存学院（系、所）备案。

该生应及时重作选题报告。

4．选题报告工作一般应于第二学期内或第三学期初进行，并将硕士生的选题报告评审表留存学院（系、所）备查。

电场刺激及共培养环境对IPS细胞迁移的实验四、目前已具备的实验条件目前在细胞培养部分，我课题组已完成了IPS细胞进行了充分的鉴定工作；能够熟练掌握对选题报告环境刺激对人IPS细胞迁移的影响的体外研究实验徐良慰一、选题背景目前，感音神经性耳聋仍是严重影响人类内耳听力健康和生活质量的顽疾之一，根据我国第二次残疾人抽样调查结果显示听力言语残疾人群已达到2780万，每年新增听力残疾人超过30万，居世界各国之首位。

临床上治疗双耳重度及极重度感音神经性耳聋的一种常用方法就是人工耳蜗植入。

人工耳蜗基本原理是将外界声音信号处理后转换为电信号，传达至内耳，刺激残余听神经，使患者获得听觉感受。

但是人工耳蜗植入也有其局限性，它并非一种根治手段，其治疗效果受限于螺旋神经元结构和功能的完整性等多种因素。

近年来，干细胞及相关技术为再生医学研究，特别是为内耳毛细胞再生和修复损伤的螺旋神经元研究提供了理想的材料和方法。

根据干细胞的不同发育阶段，可将其划分为：胚胎干细胞和成体干细胞。

根据干细胞的分化潜能，又可将其划分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

胚胎干细胞和成体干细胞是干细胞移植治疗耳聋疾病的两种候选细胞。

胚胎干细胞为多潜能干细胞，可以分化为多种类型的神经细胞，因受到伦理学问题的限制，目前仅限于动物实验。

成体干细胞具有横向分化潜能，在一定的条件下培养可以分化为神经细胞或毛细胞。

患者的自身成体干细胞移植克服了免疫排斥反应和伦理学问题的整论，是干细胞移植治疗耳聋疾病较为理想的细胞。

细胞重编程是将已经分化成熟的体细胞在体外编程后，将其逆转为一种未分化的状态，被逆转后的细胞具有多能性。

2006年8月日本京都大学Yamanaka研究小组首次将小鼠成纤维细胞诱导为多潜能干细胞（Induced pluripoten sten cells.IPS)。

简称“IPS细胞”。

IPS细胞不仅在细胞形态、表面抗原、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，而且摆脱了围绕人类胚胎干细胞使用问题的政治和伦理争论，避免了患者异体干细胞移植引起的免疫排斥反应等优点，为干细胞移植治疗耳聋疾病提供了新的思路和方法。

在应用干细胞治疗的过程中，首当其冲的问题就是干细胞的迁移和归巢。

如何快速有效地引导移植的IPS细胞向靶器官定植并发挥治疗作用，是当下干细胞研究的一个热点和难点。

内源性生物电场广泛存在于各种组织器官，对胚胎发育、创伤修复、组织再生和肿瘤侵袭等过程中的细胞行为和活动具有重要作用。

实验研究显示生理强度电刺激对多种细胞迁移行为可产生重要影响。

近年国内外学者应用外源性直流电场模拟内源性生理性电场来观察电场对组织细胞行为的影响及作用机理，以期利用电场的生物学效应为一些临床疾病的治疗和诊断提供新的策略。

因此我们课题组首次提出在植入IPS细胞的同时进行人工耳蜗植入，希望通过人工耳蜗电极发出的电刺激诱导IPS细胞向耳蜗定向迁移，到达毛细胞或螺旋神经节神经元受损区域，以发挥干细胞的治疗作用。

本课题主要为IPS 干细胞治疗联合人工耳蜗植入研究的体外实验。

二、选题主要内容、目的及意义近年来，对于生理强度电场对细胞迁移的影响等方面的研究主要是应用直流电场，较少应用电荷平衡式双向脉冲电流，这是人工耳蜗最常用的安全刺激模式，可以很好的模拟人工耳蜗植入后在体内对干细胞的刺激，使体外实验的结果对于应用IPS移植联合人工耳蜗植入的治疗更具有参考意义和实用价值。

本课题主要目的在于探究人IPS细胞在人工耳蜗电极刺激下的定向迁移，必须充分考虑到耳蜗环境内的残余螺旋神经元和毛细胞对干细胞迁移的影响，因此本课题设计了IPS细胞分别与螺旋神经元和基底膜共培养条件下，辅以人工耳蜗电极电场刺激的部分实验，使得实验结果更具有可靠性，并为在IPS细胞移植治疗感音神经性耳聋过程中，寻找一种快速有效地引导干细胞归巢的方法提供方向性的指导。

三、主要研究方法和技术路线研究方法：本实验首先大量培养扩增带有绿色荧光蛋白标记的IPS细胞，同时通过手术方式获得鼠类的螺旋神经元细胞和基底膜，尝试将IPS 细胞分别与螺旋神经元细胞和基底膜共培养，观察共培养对IPS细胞的迁移是否有促进还是排斥或是无明显作用。

再通过加电场刺激和不加电场刺激的方法分为电场组和对照组，在细胞生物学、免疫荧光、流式细胞仪、活细胞长时间观察工作站、显微镜成像等技术支持下，观察单独使用人工耳蜗电极刺激以及联合耳蜗螺旋神经元和基底膜等环境因素对IPS细胞迁移的作用，并记录各种因素单独或联合作用下IPS细胞的细胞行为、细胞形态、细胞表面多能性标记物等情况。

技术路线：（一）细胞培养：1、带有绿色荧光蛋白的IPS细胞的培养和扩增。

2、手术获取SD大鼠蜗轴组织（内含螺旋神经节），用组织块培养法培养出螺旋神经元。

3、手术获取乳鼠耳蜗基底膜，以无血清培养法培养1天后改用IPS培养系统继续培养。

4、共培养体系的探索：第一种方法为玻片培养法，分别将IPS细胞、螺旋神经元和基底膜在玻片上贴壁生长，将生长状态良好的细胞放入无血清培养体系中共培养，显微镜下观察细胞行为和形态。

第二种方法为TRANSWELL培养法，将培养好的IPS细胞加入TRANSWELL的上层小室，螺旋神经元和基底膜分别加入下层小室，通过TRANSWELL细胞迁移实验计数细胞迁移率。

并使用免疫荧光染色等方法观察共培养后螺旋神经元和基底膜的细胞状态。

（二）加入电场刺激：1、人工耳蜗电极刺激细胞装置的研制，对其安全性的观察。

2、人工耳蜗电极刺激装置分别对IPS细胞组，IPS细胞与螺旋神经元共培养组，IPS细胞与基底膜共培养组进行刺激实验，同时应用活细胞长时间观察工作站录像，进行数据记录和分析，内容包括细胞迁移的速度和方向、细胞形态学变化等，并将实验结果按照以下分组记录：EF+IPS，EF+IPS+SGN，EF+IPS+BM。

对照组为不加入电场刺激，分别记为：NEF+IPS，NEF+IPS+SGN，EF+IPS+BM。

3、使用流式细胞仪检测IPS细胞的表面多能性标记物。

4、统计方法：（1）使用QuickField有限元分析软件分析电场参数，包括电压、电流密度和方向。

（2）活细胞长时间观察工作站的图像处理使用NIH Image J 软件。

（3）采用SPSS 17.0统计软件：依据实验数据类型分别采用方差分析、t检验、卡方检验及相关分析等，以P值＜0.05认定其差别有统计学意义。

四、目前已具备的实验条件1、目前在细胞培养部分，我课题组已完成了IPS 细胞的大量扩增培养，并对IPS细胞进行了充分的鉴定工作；能够熟练掌握对SD大鼠和乳鼠耳蜗内取材的手术方法，培养螺旋神经元细胞和耳蜗基底膜。

2、目前已完成人工耳蜗电极刺激装置的设计、组装改造，并对其安全性和可操作性进行了测试，能够保证充分模拟人工耳蜗在体电刺激模式。

五、预期目标1、完成对IPS 细胞与螺旋神经元和基底膜共培养方法的探索。

观察共培养对IPS 细胞迁移的影响。

2、确定外源性电场对IPS细胞定向迁移的作用。

3、分析比较单独使用外源性电场和电场联合共培养方法对IPS细胞迁移作用的影响。

六、创新点1、首次引入人工耳蜗电极对IPS干细胞进行电场导向性研究，并同时考虑了基底膜和残余螺旋神经元对该电场作用的综合影响，这对应用干细胞治疗以及联合人工耳蜗治疗感音神经性耳聋具有十分重要的指导作用。

2、在前人探索了众多干细胞，诸如神经干细胞、间充质干细胞等与基底膜共培养的方法的基础上，进一步探索了IPS细胞与基底膜，IPS细胞与螺旋神经元共培养的方法，同时研究了基底膜或螺旋神经元对IPS是否具有引导其迁移的功能。

七、实验中的难点及解决方法1、细胞培养过程中的污染——解决方法：注意无菌操作；干细胞培养使用专门的培养箱，贴壁培养的细胞注意轻关门，以免影响贴壁生长；手术使用的动物来源正规，清洁；注意培养基的无菌，并加入抗生素等；定期清理培养箱和细胞间。

2、共培养方法的失败——解决方法：若使用同一种培养体系的共培养方法失败，则重点攻克使用TRANSWELL培养法；继续查阅文献，尤其是外文优质文献，寻找新的培养体系。

3、电场装置的改良和参数设置——解决方法：在人工耳蜗公司进修学习人工耳蜗工程学、听力学等知识理论，学习使用人工耳蜗调试软件；与清华大学物理系合作建立电场，测量电场参数等。

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