蛋白质含量测定方法
定量测定蛋白质含量的方法及原理
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药典-蛋白质含量测定(紫外吸收法、Lowrry法、双缩脲法)
3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。
以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。
用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。
紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。
计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。
蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。
1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。
3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。
2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。
蛋白质的含量测定方法
蛋白质的含量测定方法一、前言蛋白质是生命体中不可或缺的重要组成部分，对于研究生命科学、医学、农业等领域都有着极为重要的意义。
因此，蛋白质含量测定方法也就成为了这些领域研究的基础之一。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，并详细说明其原理及操作步骤。
二、生物素-琼脂糖凝胶电泳法1. 原理生物素-琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的半定量分析方法，其原理是利用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电泳将样品中的蛋白质分离出来，并利用生物素与特异性抗体结合进行检测。
由于该方法操作简便，需要样品较少且具有较高的灵敏度和特异性，因此被广泛应用于各个领域。
2. 操作步骤(1) 制备琼脂糖凝胶：按比例配制琼脂糖溶液并加入适量缓冲液，混合均匀后加热至溶解，然后冷却至50℃左右，倒入凝胶模具中制备琼脂糖凝胶。
(2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。
(3) 电泳：将处理好的样品加入琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
电泳条件需要根据不同实验目的进行调整。
(4) 转移：将分离出来的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上并进行固定。
(5) 检测：利用生物素与特异性抗体结合进行检测。
可以使用化学发光、荧光等方法进行检测。
三、Bradford法1. 原理Bradford法是一种广泛应用于蛋白质含量测定的方法，其原理是利用染料染色反应来检测样品中的蛋白质含量。
该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，并且可以适用于各种类型的样品。
2. 操作步骤(1) 制备标准曲线：按比例配制标准蛋白质溶液，并利用Bradford染料对其进行染色反应，制备出标准曲线。
(2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。
(3) 加染料：将Bradford染料加入处理好的样品中进行反应。
(4) 摇动混合：将反应溶液摇动混合均匀。
(5) 测量吸光度：利用分光光度计测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
四、Lowry法1. 原理Lowry法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用酚-硫酸反应来检测样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量的测定测定蛋白质含量的方法
科学研究中的应用
在科学研究中，蛋白质含量的测定是 研究营养学、生物化学和食品科学等 领域的重要手段之一。通过蛋白质含 量测定，可以深入了解食物中蛋白质 的生物活性、功能和作用机制等方面 ，为相关领域的研究提供有力支持。
VS
此外，蛋白质含量测定还可以用于生 物医学和临床研究中，例如评估营养 状况、诊断疾病和监测治疗效果等。
试剂准备
根据实验要求，准备适量的试剂，如硫酸铜 、硫酸钾、硫酸铁等，确保试剂的质量和纯 度。
实验操作步骤
样品称量
按照实验要求称取一定量的样 品，记录数据。
消化处理
将称量好的样品放入消化管中 ，加入适量的浓硫酸进行消化 ，使蛋白质分解为氨基酸。
蒸馏处理
将消化后的样品进行蒸馏，使 氨基酸与硫酸分离。
测定吸光度
缺点
对某些特定类型的蛋白质（ 如血红蛋白）可能会产生干 扰。
荧光光谱法
01
原理
利用荧光物质标记蛋白质后发出 的荧光强度与蛋白质含量成正比 的原理进行蛋白质含量的测定。
03
优点
灵敏度高，可用于测定低浓度样 品中的蛋白质含量。
02
步骤
将荧光物质标记在蛋白质上，通 过荧光光谱仪测定荧光强度，根 据标准曲线计算蛋白质含量。
注意样本保存条件
样本的保存条件对蛋白质含量的测定结果有很大影响 ，应严格按照规定进行保存。
THANKS
感谢观看
、样品不均匀等。
误差评估
02
对误差进行定量评估，了解误差的大小和影响程度。
减小误差
03
针对误差来源采取相应措施，如校准仪器、规范操作、增加平
行实验等，以减小误差对测定结果的影项与建议
实验安全注意事项
三种常见蛋白质含量测定方法
三种常见蛋白质含量测定方法
蛋白质含量是决定植物质量的重要因素，在植物栽培及种子货架上，精确掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
目前，研究常用的植物蛋白质含量测定方法有Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种。
Kjeldahl法是一种多功能性的蛋白质定量方法，它可以测定含氮量甚至微量有机氮，此法在测定蛋白质含量方面易于操作，测试效率高， get精度也较高。
该法简单地以氨作为氮源，以硫酸释放氨，用硫酸钠将氨碱中的氨携带，然后进行缓冲及蒸发水解，最后通过酚酞形成深蓝色络合物对氮进行定量，从而间接的得到蛋白质的含量。
Bradford法同样是一种多用途的法子，它能够直接测定蛋白质中的色氨酸及胆羧酸含量，该方法的操作简便，使用成本低，测试效率高，可在一个小时内达到较高精度的测定结果。
Bradford法原理是将蛋白质及它的沉淀由蛋白质合酶结合至二价铬J络合物，从而形成一种光电的特异性比色反应。
Lowry法也是一种多功能性的定量方法，该方法能测定有机物中蛋白质、氨基酸等氮含量，以及各种物质中的亲合体，操作过程简单，精度也较高，比Kjeldahl法快7倍以上，Lowry法原理是蛋白质分解成其中的氨基酸，通过对色比色反应，底物络合过程自络合金属，再经冷酰膦处理，酰膦中色素降解，形成比色荧光，定量检测氮含量，从而间接得到蛋白质含量。
以上就是蛋白质含量测定常见三种方法。
从Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种方法，人们可以很好地掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质是生物体内重要的营养成分，对于人体的生长发育和健康维护起着重要的作用。
因此，准确测定食品、药物、生物样品中的蛋白质含量，对于保障食品安全和科学研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，供大家参考。
首先，常用的蛋白质含量测定方法之一是比色法。
比色法是通过蛋白质与某种试剂发生化学反应，产生有色产物，再利用光度计测定产物的吸光度来间接测定蛋白质含量。
其中，最常用的试剂是布拉德福试剂和伯尼斯试剂。
这种方法操作简便，测定结果准确，因此被广泛应用于食品、生物样品的蛋白质含量测定。
其次，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是比浊法。
比浊法是通过蛋白质与某种试剂发生沉淀反应，根据沉淀的浑浊度来测定蛋白质含量。
常用的试剂有硫酸铵和三氯乙醛。
比浊法操作简便，成本低廉，适用于大批量样品的测定。
另外，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是氨基酸分析法。
氨基酸分析法是通过水解蛋白质，然后利用色谱仪或氨基酸分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。
这种方法对于蛋白质的成分分析非常准确，但操作复杂，需要专业设备和技术支持。
最后，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是生物素标记法。
生物素标记法是将生物素标记在蛋白质分子上，然后利用生物素与酶的特异性结合来测定蛋白质含量。
这种方法对于高灵敏度的蛋白质测定非常有效，但需要专门的标记试剂和设备支持。
总之，蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其适用的场合和特点。
在实际应用中，需要根据样品的特点和实验条件选择合适的测定方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的几种常用方法能够为大家在蛋白质含量测定方面提供一些帮助。
蛋白质测定方法
蛋白质测定方法蛋白质是生物体内一种重要的有机物质，对于生物体的生长、发育和代谢具有重要作用。
因此，蛋白质的测定方法显得尤为重要。
本文将介绍常见的蛋白质测定方法，希望能够为相关研究和实验提供帮助。
一、Lowry法。
Lowry法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是利用蛋白质与铜离子和碱性试剂在碱性条件下发生的还原反应，生成紫色络合物，通过比色测定蛋白质含量。
该方法具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点，适用于多种类型的蛋白质样品。
二、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子的蛋白质测定方法，原理是蛋白质与试剂中的碱性铜离子在碱性条件下发生蓝色产物，通过比色测定蛋白质含量。
相比于Lowry法，BCA法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，适用于高通量的蛋白质测定。
三、Bradford法。
Bradford法是一种基于染料结合的蛋白质测定方法，原理是蛋白质与染料结合后产生颜色变化，通过比色测定蛋白质含量。
该方法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，对于一些含有胶体物质或其他干扰物质的样品，Bradford法的选择性更好。
四、UV吸收法。
UV吸收法是一种常用的蛋白质测定方法，原理是利用蛋白质特有的氨基酸在紫外光区域的吸收特性，通过测定蛋白质在280nm处的吸光度来定量测定蛋白质含量。
该方法操作简便、快速，适用于纯化后的蛋白质样品的测定。
五、荧光法。
荧光法是一种基于蛋白质荧光特性的测定方法，原理是蛋白质在特定激发波长下产生荧光信号，通过测定荧光强度来定量测定蛋白质含量。
该方法具有灵敏度高、选择性好的特点，适用于高通量的蛋白质测定。
六、总蛋白法。
总蛋白法是一种常用的蛋白质测定方法，原理是利用蛋白质与试剂中的染料结合后产生颜色变化，通过比色测定蛋白质含量。
该方法操作简便、快速，适用于多种类型的蛋白质样品。
总结。
蛋白质的测定方法多种多样，选择合适的方法需要根据样品的特性、实验的目的和仪器设备的条件来综合考虑。
希望本文介绍的蛋白质测定方法能够为相关研究和实验提供参考，促进科研工作的开展。
蛋白质含量测定方法汇总[整理]
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蛋白质含量测定方法汇总[整理]蛋白质含量测定是一种用于测定任何生物样品中蛋白质含量的有效测试方法。
此外，蛋白质含量也可以被用于检测不同生物样品中的样本污染程度的指标，以及生物样品中某种从另一个样本污染的量。
现今，存在许多蛋白质含量测定的方法，通常称作“蛋白质测定方法”，它们常用于检测各种类型的高分子生物物质，如蛋白质、核酸、多糖、脂类等。
下面总结了一些常见的蛋白质含量测定方法：1、分子吸光法：分子吸光法是一种常用的蛋白质测定方法，它利用液体或气体样品中分子的光吸收特性来测量蛋白质的含量。
它通过测量样品当量吸收辐射的强度来测量含量，并通过分子结构及激发能获取分子吸收率。
2、酶标法：酶标法是一种常见的蛋白质测定方法，它使用特定酶将蛋白质转化为可测试物质来准确估算样品中蛋白质含量。
此外，也可以用其他物质作为指示物来改变酶反应的速率，从而获取蛋白质含量。
3、体外测定法：体外测定法是一种常见的蛋白质测定方法，它可以任意选择探测，即特定蛋白质向特定外部刺激物反应的速率，以反映样品中的蛋白质含量。
它在分析较新的样品以及批量定量分析中有很大的优势。
4、表面增强拉曼光谱：表面增强拉曼光谱是一种新的蛋白质测定方法，它利用光的调制前后产生的均方根像素来测量蛋白质的含量，这种方法可在低浓度范围内准确定量样品中的蛋白质含量。
5、比多肽配体应答行为水平测定：比多肽配体应答行为水平是一种常见的蛋白质测定方法，它利用特指性多肽核酸探针乙酰化后，在特定条件下发生应答强度及反应速率的改变，从而测量样品中的蛋白质含量。
这是一种可以在短时间内实现高灵敏度和高精度的测定方法。
6、限制性酶体系：限制酶体系是一种常见的蛋白质测定方法，它利用限制性酶来切割或降解蛋白质链，从而得到可用于测定蛋白质含量的切片产物。
限制酶体系也能够有效地检测末端特异性蛋白质种类，以及它们的分布情况。
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蛋白质含量测定院系名称食品与生物工程学院学生姓名孙洪磊学号 2专业班级生工06 - 2指导教师马美范二○○九年四月一日蛋白质含量测定方法比较蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。
2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
二、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。
表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。
最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700）2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
三、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。