DNA多态性及其分析

中有一类较短的，称为～。许多基因的内含子部 分含有此类序列。


特点：G＋C含量高
插入或缺失此类序列的事件发生频繁 ，有时还会 发生跳跃复制的现象。 1985年，Jeffreys等 首先用人肌红蛋白基因内含子中一段高度重复的 小卫星DNA为探针，获得了具有个体特异性的 DNA指纹图谱。


中度重复的散在重复序列 ：

BamHI 识别序列：
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’


2．核酸探针
由于人基因组DNA链很长，用某一限制性内切酶消化 后，酶解出来的各种不同长度的片段往往数量巨大， 电泳后几乎是连续排列的，无法进行分析比较。 选取某种特定的DNA片段作为探针，标上一定的标记 物（如同位素、生物素等），利用碱基互补的两条 DNA单链能结合（杂交）的原理，就可以在连续排列 的一系列DNA片段中显示出与探针有同源序列的某些 DNA片段。 不同的DNA探针会显示出不同类型的 RFLP 图谱。
（3）重复序列探针 如α小卫星DNA，其重复单位群集在 基因组的某一特定区域。 重复序列探针能检测出基因组中多 处具有此类重复序列的DNA片段。
特点：能一次性检测出多个位点的 DNA片段多态性

Jeffreys等从第22号染色体上肌红蛋白基因的内 含子中分离出来的高度可变的“小卫星DNA” 探针。 并证明两个无关个体之间，这类多态性相同的 机会极微（只有3×10－11），因而他称这种 RFLP图谱为DNA“指纹”。


四．线粒体的DNA多态性

线粒体 DNA 属于核外基因，表现为非孟德尔规 律遗传。 人mtDNA D环一端347bp的序列分析资料证明， 两个无关个体间，这一段 mtDNA 序列完全相同 的可能性只有0.27%（即1/370）。


因此， mtDNA 序列组成的多态性同样可以用作 个体识别。


散在重复序列的某些重复单位可能是转座子 （transposon）。
——一种能够反复插入到基因组中许多位点的 特殊DNA片段。它可以从基因组上一个位点转 移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个 复制子。
三．性染色体多态性

X 染色体 —— 着丝粒周围也有一类重复序列形 成X染色体的VNTR类多态性。 Y 染色体 —— 在哺乳动物的染色体中 Y 染色体 似乎是最少保守性的。 用不同的限制性内切酶和DNA探针，可以揭示 出Y染色体特异性片段的多态性。
DNA多态性及其分析技术
免疫与分子生物学技术研究室 董 燕
广州中医药大学 临床药理研究所
第一节 多态性概述


一．定义
自然界的生物有千百万种，每一种生物的个体之间存在着许多的 差异。一种生物群体内，某一性状方面也存在着不同的个体变异。

不同种的生物以及同一种生物的不同个 体之间都存在着许多差异，称为生物的 多态现象，即生物的多态性。 （polymorphism）

1
2
A 含1,2两个酶切位点的DNA片段
2
B 点突变使酶切位点1缺失
1 2 3
C 点突变产生酶切位点3
1 2
D 序列重排使酶切位点2移位
1
E 含有酶切位点2的片段缺失
1 2
F 序列插入，如存在数量不同的串
联重复序列，即VNTR


采用合适的限制性内切酶 切出一系列长度的DNA片段 根据片段是否长度一致这些片段进行杂 交 图谱反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在 差异。


探针分类
：
（1） 基因探针
大多数取自人基因组中某一基因的一个片段。 人类基因组中，最早确定有多态性的是α 珠蛋白基因位点和胰岛素基因位点。 cDNA探针 ——用mRNA反转录成cDNA，探测 的是此基因中的外显子部分。
人工合成——可以随研究者的设计而合成
（2）随机探针
随意挑选出的DNA片段 要能够揭示出人基因组DNA的酶切片段长 度多态性就行。 特点：能比较快地了解该染色体的某些限制性 片段多态性与研究对象（如某种疾病基因）的 相关性。 片段较大的随机DNA探针比片段较小的更 易检测出RFLP来

应用：
亲子鉴定 人类学研究
法医学个人认定 遗传病相关性分析
人的DNA指纹分析示意图
子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中 相应的分子杂交条带相对应
（4）人工合成的寡核苷酸探针
1986年，Ali等以 Alu I 和 Mbo I 酶消化人基 因组DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷 酸作探针进行检测，发现其RFLP图谱同样具有 个体特异性。 这类探针检测的对象主要是人基因组中的 散在重复序列DNA。
RFLP——通过核酸的限制性酶切片段长度多态 性来揭示DNA碱基序列组成的不同，因而称为 限制性酶切片段长度多态性技术。
（二）RFLP技术的基本步骤

抽提DNA（从血或组织） 限制性内切酶消化
培养细菌 质粒纯化
人工合成探针
靶

纯化探针 琼脂糖凝胶电泳 标记探针（同位素或非同位素） Southern转移、固定 预杂交

（1）不同个体——核心序列重复的次数不同


（2）不同的串联重复序列，其核心序列的组成会不同
（3）在核心序列之间，有时不同的个体间会存在有无 插入小段的DNA序列或插入的片段长短不同之差
两个无关个体之 间的VNTR的变异 能达到完全个体 特异的程度
DNA指纹

小卫星DNA（minisatellite DNA）:串联重复序列
②反应条件：包括反应液的pH，内含乙醇、甘油的量，
反应温度和时间等，以及DNA的质量和浓度 。 星号*活性，即非特异性酶解活性
限制性核酸内切酶——能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸 内切酶。 识别位点：回文序列 反转重复序列，即旋转对称结构 一般为4~8个碱基对 例如 EcoRI 的识别序列： 5＇-GA A T T C-3＇ 3＇-C T T A A G-5’
二．重复序列多态性

串联重复序列 ——相同的核心序列（core sequence） 按首尾相接的方式排列。
在重复序列两翼， DNA片段的碱基 组成相同
GATC
限制性内切酶
GATC
不同长度的 DNA片段
A B
1
GATC GATC
大 片 段
2 ssDNA探针
小 片 段
由于不同的个体其核心序列重复的次数不同，应用限制性 内切酶酶切时，形成不同长度的DNA片段，这类多态性被称 为VNTR（variable numbers of tandem repeats，VNTR）， 可变数串联重复序列多态性 。



多态性：发生遗传分离的基因座位（locus）具 有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因 的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被 认为具有多态性。
个人——一对等位基因（如ε1 /ε2 ，或ε2 /ε3） 人群——复等位基因（如ε1 、ε2 、ε3、 ε4）,如 ABO血型基因、人类白细胞抗原基因
第二节 DNA多态性的分类

一．基因多态性 二．重复序列多态性
三．性染色体多态性
四．线粒体的DNA多态性
一．基因多态性

基因的多态性
遗传表型的多态性

在生物群体中，对于某一基因座位来说，属于 这一位点的等位基因越多，这一座位的基因多 态性就越复杂 。

HLA 白细胞抗原系统：仅HLA-DR抗原的编码 位点就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4， B5等10个座位，超过200个等位基因 。

二态性（dimorphism）：在某些时候，一个基 因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置 上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无” 两种情况，被称为二态性。


遗传多态性广泛存在于生物界。
果蝇有着大量的蛋白质水平上的遗传变异 哺乳动物的免疫球蛋白有高度的遗传多态性 即使是纯系的小鼠，其免疫球蛋白IgG2a重链编码区 1108个碱基中就有110个（10%）的碱基组成互不相同， 其中有18个碱基替换是同义的，其余的变异则编码不 同的氨基酸。
环境因素
营养、气候、疾病等
遗传因素
遗传多态性
遗传多态性（genetic polymorphism） 不同个体之间，其生化特征、抗原特性都 存在着由遗传造成的变异，形成一系列的 多态性，由相应的基因控制。
生物进化
二．标准


基因座位：基因在染色体上的位置 等位基因（alleles)：二倍体个体中， 位于一对同源染色体相等位置上（相同 座位上），控制着同一性状的基因，具 有两种或两种以上的形式。 纯合子：二倍体中，在一定的座位上带 有两个相同的等位基因的个体。 杂合子：在一定的座位上带有两个不同 的等位基因的个体。（一般是针对所研 究的一对或几对基因而言。）
SNP 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)
指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有 已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000 个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚 至更多。

一．RFLP分析技术

（一）基本原理

限制性酶切片段长度多态性技术，简称 RFLP技术（restriction fragment length
polymorphism，RFLP）

1. 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 能够识别DNA双链上特异 的碱基序列并能将之切断。不同的限制性 内切酶有各自特异的识别序列，一般为4~8 个碱基对 。 2. DNA区段碱基组成不同。用一种限制性 内切酶消化，就会产生不同长度的酶切片 段。