DNA 序列多态性
DNA序列多态性
Biotin
T T T T TTTTTTTTTTTT T
PROBE
Examples:
Probe Specifications:
1 2 3 4 C 1.1 12-14 1.3 All but 1.3
AMPLIFIED DNA
IMMOBOLIZED ASO PROBE NYLON MEMBRANE
DQA type
PCR－SSCP法具有能快速、灵敏地检测有 无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突 变的碱基性质，则需作序列分析。
PCR扩增
PCR-SSCP
快速复性 单链构象形成
电泳，分析
PCRSSCP
Structure of Maldi-TOF
Laser Sample
Linear Reflector
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
RFLP
§3 PCR-RFLP
RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可 遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。
RFLP可用Southern印迹杂交法检出。
§3 PCR-RFLP
PCR与RELP相结合
A/O
CACCCCGGCTTCT
B
CACCCCAGCTTCTAl I§4 MVR 特点：既有长度差异，又有序列差异
对特定碱基（或特定类 型的碱基）进行化学修饰 修饰碱基从糖环上脱落 修饰碱基5’和3’的磷酸 二酯链断裂
Protein-DNA
Sanger
Born August 13th, 1918 in Rendcombe, Gloucestershire. His father (also Frederick Sanger), was a medical doctor who inspired his son to persue biology. Ph.D. in biochemistry during the war on lysine metabolism.
生物信息-名词解释
逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）。
全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装。
单核苷酸多态性(SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
遗传图谱又称连锁图谱，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。
遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。
物理图谱是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。
绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。
转录图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。
比较基因组学：全基因组核苷酸序列的整体比较的研究。
特点是在整个基因组的层次上比较基因组的大小及基因数目、位置、顺序、特定基因的缺失等。
环境基因组学：研究基因多态性与环境之间的关系，建立环境反应基因多态性的目录，确定引起人类疾病的环境因素的科学。
宏基因组是特定环境全部生物遗传物质总和，决定生物群体生命现象。
转录组即一个活细胞所能转录出来的所有mRNA。
研究转录组的一个重要方法就是利用DNA芯片技术检测有机体基因组中基因的表达。
而研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组学。
蛋白质组学：研究不同时相细胞内蛋白质的变化，揭示正常和疾病状态下，蛋白质表达的规律，从而研究疾病发生机理并发现新药。
蛋白组：基因组表达的全部蛋白质，是一个动态的概念，指的是某种细胞或组织中，基因组表达的所有蛋白质。
代谢组是指是指某个时间点上一个细胞所有代谢物的集合，尤其指在不同代谢过程中充当底物和产物的小分子物质，如脂质，糖，氨基酸等，可以揭示取样时该细胞的生理状态。
第五章 DNA序列多态性
自动序列分析仪
自动序列分析仪
荧光标记方法
Dye-Primer： 用荧光染料预先标记在测序反应引物的5′端，4种 荧光标记形成4种标记引物 在4个管中进行测序反应，特定荧光染料与相应的 ddNTP是对应关系 由同一种ddNTP终止的所有延伸链5′端都带有同一 种荧光染料。 Dye-Terminators： 用荧光染料标记ddNTP 4种荧光标记分别与4 种ddNTP底物连接 在1个管中进行测序反应， 反应产生的4组被不同ddNTP终止的延伸链分别标记 有4种不同荧光
mt DNA序列多态性在个人识别中的最大价值在于检测灵敏 度高，具有STR分析无法比拟的优势。 拷贝数多，当基因组DNA不能完成STR分型时， mt DNA序 列分析可能获得成功 尤其在毛发、指甲、骨骼等非常规检材的鉴定中有实用价值
（2）鉴定意义不在于认定，而在于排除同一性
① 母系遗传： 同一母系后代， mt DNA序列相同； 可将遗传情况追溯到一代以上，适用于失踪人员； 对于母子、母女等母系亲缘关系鉴定有参考价值。
测序反应
标准的测序反应设臵4个反应管。 每个反应管对应一种碱基，除加入待测 单链DNA模板、引物、标记dNTP、聚合酶 外以及缓冲液外，还加入一种ddNTP，合 成相应碱基为末端的系列片段。 四个管分别产生A、G、C、T四种不同 碱基为末端的长度不等的片段。
一次测序：经历变性→退火→延伸一个 循环的测序反应过程
模板与引物
模板：单链DNA 或碱变性的DNA
制备方法：构建重组体DNA
引物：通用引物
以靶DNA片段两侧翼的载体已知序列作为测 序反应的引物。 由于克隆载体的序列是已知的，可引导任何靶 DNA片段的测序反应，故被称为通用引物
模板与引物
SNP分型技术简介
SNP概念
SNP（single nucleotide polymorphisms ）单核苷酸多态性
是指在基因组水平上由单个核苷酸的改变所引起的DNA 序列多态性。
单 个 ？ 核苷酸 ？ 多态性 ？
突变 与 多态性
1. 多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以 上。否则就叫突变（小于1%）。 2. SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。 3. SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型。 4. 突变一般不是一个个体全部体细胞的变化。 5. 如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突 变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系；达到 了1%就是多态性了。
编码区snp有同义和非同义2种非同义突变由于会导致氨基酸的变化从而影响蛋白质的功能特别是发生在结构功能区域的snp尤其重要非同义突变虽然没有明显的功能的分子机制但是在遗传学上可能因为与附近的其它致病基因的表达或者snp连锁因此在流行病学上形成阳性结果一般以此解释
SNP分型简介
单核苷酸多态性分型 SNP技术交流QQ群：107750067
SNP研究的优势 1. SNP在基因组中每500-1000个碱基就有一个标记。无论是比 较于RFLP还是SSR（6000一个标记），都要广泛得多； 2. SNP在人群中是等位基因性的，在任何人群中其等位基因 频率都可估计出来； 3. 与微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码 区的SNP，而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出 现困难； 4. 部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构 或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制 的候选位点； 5. 易于自动化、规模化分析，缩短了研究时间。
公开的SNP 数据库：
人类基因组多态性的基础和意义
人类基因组多态性的基础和意义随着现代医学的不断发展，认识到人类基因组的重要性日益加深。
人类基因组是指所有人体细胞中含有的遗传信息，“基因组多态性”指的是不同人之间基因存在差异的情况，也就是遗传多样性。
这些基因差异对于人类的生理和心理特性有着巨大的影响，同时也对医学和研究等方面具有极大的意义。
一、基因组多态性的基础基因组多态性的基础主要是DNA序列的差异。
DNA是构成基因的基础单元，它由四种核苷酸A,T,C,G组成，不同的序列排列决定了基因的不同功能和表达。
人类的基因组存在大量的多态性位点，即DNA序列中不同的位置上可能会存在不同的核苷酸。
这些位点的差异形成了人类各种基因型的分布情况，使得人类基因组具有了极高的多样性。
此外，基因组的多态性还包括了单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失多态性（InDels）等多种类型。
二、基因组多态性的意义1、基因组多态性与人类健康的联系基因组多态性在医学上具有重要的意义。
许多人类疾病都与人类基因组的多态性有关，例如糖尿病、高血压、癌症和心血管疾病等。
基因组多态性的差异也能用来解释为什么有些人对某些药物不敏感或反而有不良反应。
在营养学方面，人类基因组的多态性也与不同营养素的吸收率和代谢率有关，能更好的指导人类营养的调整和管理。
2、基因组多态性与人类进化的联系基因组多态性也是人类进化的一个重要证据。
长期以来，人类面对着大量的自然选择和适应挑战，从而在人类基因组中留下了大量的多态性。
基因组多态性的差异也可以研究人类各种群体之间的历史状态和演化关系，加深对人类起源和演化的理解。
3、基因组多态性与个体差异基因组多态性不仅存在于不同个体之间，也存在于不同组织、不同时期和不同环境下的同一人体内。
这种多态性导致了人类各种个体差异，与个体的性别、种族、环境条件等也有关。
基因组多态性的这种不同造成了人类在生理表现上的差异，例如各种天赋或性格的表现，能够判断一个人在某些方面会比另一个人更出色或者更容易出现健康问题。
DNA多态性及其分析
DNA多态性及其分析DNA多态性是指DNA序列在人群或物种中存在的差异。
这些差异可以以单个核苷酸的替代（单核苷酸多态性，SNP）、插入（插入/缺失多态性，INDEL）或重复序列（重复序列多态性）等形式存在。
这些多态性可以对个体之间的遗传差异进行研究，并被广泛用于种系关系、疾病易感性、药物反应等方面的研究。
DNA多态性的分析是指通过不同的实验方法来研究DNA中的差异。
常用的分析方法包括PCR（聚合酶链式反应）、测序、引物扩增长度多态性（PCR-RFLP）、串联重复序列（STR）等。
下面将详细介绍各种分析方法及其应用。
PCR是一种广泛应用的DNA分析方法，通过特定的引物扩增特定DNA序列，从而实现对该序列的研究。
PCR通常通过选择性引物来扩增目标序列，然后通过电泳或测序等方法来检测PCR产物。
PCR在研究DNA多态性中被广泛应用，例如通过扩增SNP位点来研究个体的遗传差异。
测序是一种可以直接读取DNA序列的方法，可以精确地测定DNA中的碱基序列。
测序方法包括Sanger测序、NGS（Next-Generation Sequencing）等。
测序方法可以用于鉴定SNP、INDEL等多态性，并且可以在同一次实验中检测多个位点。
PCR-RFLP（引物扩增长度多态性）是一种通过PCR扩增特定DNA序列后再通过限制性酶切来检测DNA多态性的方法。
不同的基因型会产生不同的酶切片段，从而可以通过电泳等方法来检测不同的基因型。
PCR-RFLP方法简单、便宜，并且适用于大规模筛查。
STR（串联重复序列）是指在DNA中串联重复的小片段DNA序列，STR位点的多态性通常由重复单元的数目和结构差异所决定。
STR是DNA指纹分析的主要依据，可以在法医鉴定、亲子鉴定等方面发挥重要作用。
DNA多态性的分析在生物学、医学等领域有广泛的应用。
例如，在种系关系研究中，通过分析DNA多态性可以揭示不同群体或物种之间的遗传关系。
在疾病研究中，通过对DNA多态性的研究可以发现与疾病相关的位点，从而对疾病的易感性进行分析。
DNA多态性分析基础详解
DNA多态性分析基础详解DNA多态性分析（Polymorphism Analysis of DNA）是一种用以研究个体之间基因组差异的分析方法。
DNA多态性是指DNA序列的差异，这些差异可能会导致个体之间的遗传差异。
DNA多态性可以作为人类遗传学、分子进化学和医学研究的重要工具之一DNA多态性分析可以通过不同的方法进行。
其中常用的方法包括限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、单点突变（Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 分析、序列分析和扩增子长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等。
RFLP是一种具有高度位点特异性的分析技术。
这种方法是基于限制酶特异性切割DNA，然后通过电泳将产生的DNA片段分离，并通过染色剂将其可视化。
RFLP可以用于检测DNA序列的特定变异位点，从而确定个体之间的差异。
SNP分析是目前最常用的DNA多态性分析方法之一、这种方法利用PCR扩增待检测的DNA片段，然后使用特异性引物结合DNA序列进行扩增。
产生的扩增产物将通过电泳分离，并通过测序或其它方法来检测SNP位点的具体变异。
序列分析是一种直接检测DNA序列的方法。
它利用测序技术来确定个体之间的差异，通常应用于长序列的DNA分析。
序列分析可以提供更精确的结果，但是相对较为耗时和费用较高。
AFLP则是一种无需基因序列信息即可研究DNA多态性的方法。
这种方法将限制酶切割DNA，然后使用引物对产生的DNA片段进行扩增。
产生的扩增产物经过电泳分离并可视化，从而了解个体之间的差异。
DNA多态性分析在人类遗传学研究中具有广泛的应用。
它可以用于亲子鉴定、个人特征分析、基因功能研究以及疾病易感性筛查等领域。
在医学研究中，DNA多态性分析可以用于确定特定基因变异与特定疾病之间的关系，从而为疾病的早期诊断和个体化治疗提供依据。
SNP
(single nucleotide polymorphism ，SNP，发音为“snips”), 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90% 以上。
SNP 在人类基因组中广泛存在，平均每500 ～1000 个碱基对中就有1 个，估计其总数可达300 万个甚至更多。
(1) SNPs在基因组中的分布（每500-1000个碱基就有一个标记）无论是比较于RFLP限制性片段长度多态性分析还是STR微卫星标记（6000-7000多个Markers），都要广泛得多；(2) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来；(3) 与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP)，而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难；(4) 部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点；(5)易于进行自动化、规模化分析，缩短了研究时间。
在基因组DNA 中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。
总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP) 比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5 。
但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。
从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2 种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP), 即SNP 所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP), 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。
这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。
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MALDI-TOF MALDI-TOF
DHPLC
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DQA type
2, 3 1.1,3
*Allele-Specific Oligonucleotide
§3 PCR-RFLP
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切 点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切 时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切 点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制 性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。
RFLP
§3 PCR-RFLP
RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可 遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。 RFLP可用Southern印迹杂交法检出。
§3 PCR-RFLP
PCR与RELP相结合
A/O B
CACCCCGGCTTCT CACCCCAGCTTCT Alu I
§4 MVR
特点：既有长度差异，又有序列差异 串联重复 重复序列中存在点突变 以重复序列设计序列特异性引物
§1 DNA测序及多态分析
什么是测序 对DNA分子一级结构的分析----A T C G的排列 Sanger双脱氧核苷酸链终止法（1977） 循环测序 Maxam化学降解法（1977） 自动测序
测序基本原理和技术
Maxam化学 降解法
对特定碱基（或特定类 型的碱基）进行化学修饰 修饰碱基从糖环上脱落 修饰碱基5’和3’的磷酸 二酯链断裂
PCR-SSCP
PCR扩增
快速复性 单链构象形成
电泳，分析
PCRSSCP
Structure of Maldi-TOF
Laser Linear Reflector Sample MCP Photomulti -plier
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
The Generation of a Dot Blot for Typing Using Immobilized ASO* Probes (“Erlich” System)
COLORLESS SUBSTRATE COLORED PRECIPITATE
DYE
STREPTAVIDIN-HRP_ ENZYME CONJUGATE
测序基本原理和技术
双脱氧核苷酸 链终止法
测序基本原理和技术
循环测序
比 较
链终止法
4个反应管 同位素标记 标记dNTP 55℃ 30min 四道凝胶电泳 X光胶片 人工读片
循环测序
4个反应管 同位素标记 标记引物 PCR循环 四道凝胶电泳 X光胶片 人工读片
自动测序
1个反应管 荧光标记 标记ddNTP PCR循环 单道凝胶/毛细管电泳 激光荧光检测 计算机自动分析
§1 等位基因ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ异性探针杂交技术
基本原理： 核酸分子杂交反应 PCR-ASO探针杂交
针对序列多态等位基因序列设计特异性探针 PCR扩增各等位基因 ASO探针与PCR产物杂交反应 洗去未结合/结合不牢固的非特异性探针 检测标记物是否存在
分类 正向杂交 固定PCR产物；标记探针 反向杂交 固定探针；标记PCR产物－－DNA芯 片技术
HRP
SA
Biotin
T T T T
AMPLIFIED DNA PROBE IMMOBOLIZED ASO PROBE NYLON MEMBRANE
TTTTTTTTTTTT T
Examples:
Probe Specifications:
1 2 3 4 C 1.1 12-14 1.3 All but 1.3
PCR-ASO
-A-G-T-A-C-C-G-T-A-T-T-C-G-A-A-C-G-T-G-C-C-A-G-T-G-C-C-G-T-A-T-T-C-G-A-A-C-G-T-G-C-C-
-A-G-T-A-C-C-G-T-A-T-T-C-G-A-A-C-G-T-G-C-C-A-G-T-A-C-C-G-T-A-T-T-C-G-A-A-C-G-A-G-C-C-
Protein-DNA
Sanger
Born August 13th, 1918 in Rendcombe, Gloucestershire. His father (also Frederick Sanger), was a medical doctor who inspired his son to persue biology. Ph.D. in biochemistry during the war on lysine metabolism. In 1943, Sanger developed a method of sequencing amino acids, and deduced the complete sequence of insulin. Nobel Prize for Chemistry in 1958. "for his work on the structure of proteins, especially that of insulin" In 1962, he became facinated by nucleic acids and used earlier developments as the foundation of the Sanger sequencing method. 2nd Nobel Prize for Chemistry in 1980. "For their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids"
DNA序列多态性
张 霁
内 容
序列多态性的基本概念 序列多态性产生的机理 几种序列多态分析技术及基本原理 序列多态在法医学中的意义
总
论
什么是序列多态 特定基因座上的碱基序列差异，是不同个体间本质的遗 传差异。 AGGCTTGCACTGAGTCTT AGGCCTGCACTAAGTCTT 遗 传 遗 传 变 异 差异（突变） 多态性（个体间差异） 亲子关系、个体识别
AGTCAACGT TCAGTTGCA
CGTCAACGT GCAGTTGCA
AGTCAACGT AGTCAACGT TCAGTTGCA
CGTCAACGT A GTCAACGT G CAGTTGCA
PCR-SSCP
用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突 变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR 扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并 在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的 DNA构象差异将表现为电泳带位置的差 异，从而可据之作出诊断。 PCR－SSCP法具有能快速、灵敏地检测有 无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突 变的碱基性质，则需作序列分析。