硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶的测定
硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重)
四、实验报告
1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液
(1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶
圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定 N02-含量。
叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)
实验三 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶 液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶(NR)活性测定试剂盒说明书
硝酸还原酶（NR）活性测定试剂盒说明书硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意：正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定测定意义：NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，20℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，20℃保存；试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1mL，20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样本前处理：动植物组织样品的前处理:（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
不同形态氮素对大豆硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白质含量的影响
２ ２ １ ０１ 年 月
东 北 农
业 大 学 学 报
４ （）３ － ５ ３１ １３ ：
Ｊｎ ２ １ ａ ．０ ２
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｏｔｅ ｓ Ａｇｉ ｌ ｒｌ ｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｒ ａｔ ｒ ｕ ｔ ａ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｎ ｈ ｃ ｕ ｅ ｔ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｅ ｅｔ ｏ ｉ ｒｎ ｎ ｒ ｅ ｓ（Ｏ － ， Ｈ ＋ ， Ｏ － Ｈ ｏ ｉ ｔ ｄ ｃ ｓ Ｎ ） ｎ ｓｒ ｃ ： ｆ ｃ ｆ ｆ ｅ ｔ ｉ ｇ ｎ Ｎ ３ Ｎ ４ Ｎ Ｎ ３Ｎ ４） ｎｎｒ ｅｒ ｕｔ ｅ（Ｒ ａ ｄ ｓ ｄ ｅ ｔ ｏ Ｎ － － ｔ ａ ｅ ａ
叶 片Ｎ Ｒ、Ｇ 活性和籽粒蛋 白质含 量具有较好的促进作 用。可以把 大豆花 荚期 叶片Ｎ Ｓ Ｒ和 Ｇ 的活性作 为高蛋 白品 Ｓ
种选育的参考指标之一 。
关 键 词 ：大 豆 ；硝 酸还 原 酶 ；谷 氨 酰 胺 合 成 酶 ；蛋 白质
中图分类号 ：￥ ６ ． ５ ５１
文献标 志码 ：Ａ
研 究不 同形 态氮素对功能 叶片硝 酸还原酶（ Ｒ） Ｎ 、谷氨 酰胺合 成酶（ Ｓ 活性 以及籽 粒蛋 白质含量的影响 。结果表 Ｇ）
明 ，Ｎ ， Ｎ增 加 ３ 大豆 品种 功 能 叶 片 Ｎ Ｈ＋ － 个 Ｒ活 性 效 果 最 好 ，其 次是 混合 态 氮 ，Ｎ ３ Ｎ效 果较 差 ；三 种 形 态 的 氮素 Ｏ－ －
ｃ ｌｖ ｒ ｕ ｉｇｆ ｗｅ ｉｇ ｐ ｄｉｇ ｐｈ ｓ ｒ ｎ ｅ ｔ ａ ｅ Ｔｈ ｅ ｕｔ ｎ ｃ ｔｄ ｔ ａ ｕｔ ａ ｓ ｄ ｒ ｏ ｒ － ｏ ｎ ａ ｅ ｗｅ ｅ ｉｖ ｓ ｉ ｔ ｄ． ｅ ｒ ｓ ｌ ｉｄｉａｅ ｈ ｔＮＲ ｃｉｉｅ ｆ ｕ ｃｉｎ ｉ ｎ ｌ ｎ ｇ ｓ ａ ｖｔ ｓｏ ｎ ｔ － ｔ ｉ ｆ ｏ ａ ｅａ ｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ｓ ｙ ｅ ｎ ｇ ｎ ｔｐ ｓ ｔｅ ｔ ｄ ｂ ｈ ｅ ｉｄ ｆｎｔ ｇｅ ｓ ｗｅｒ ｈ ｃ ｄ。ＮＨ４－ ｗａｓｔ ｅ ｌｌ ｖ ｓ ｉ ｈ ｅ ｏ ｂ ａ ｅ ｏｙ ｅ ｒ ａ ｅ ｙ ｔ ｒ ｅ ｋｎ ｓ ｏ ｉｏ ｎ ｒ ｅ ｅｎ ａｎ ｅ ＋Ｎ ｈ ｂ ｓ ，ｔｅ ｓ ｃ ｎ ｓ Ｎ０３ＮＨ４ ｅｔ ｈ ｅ ｏ ｄ ｗａ － ，ａ ｄ ｔｅ ｔ ｒ ｓ ＮＯ３Ｎ．ＡＩ ｔ ｒｅ ｄｆ ｒ ｎ ｉｏ ｅ ｒ ａ ｍｅ ｔ ｕｄ ｎ ｈ ｈｉ ｗａ ｄ － ｌ ｈｅ ｉｅ ｅ ｔｎｔ ｇ ｎ ｔｅ ｔ ｎ ｓ ｃ ｌ ｒ ｏ ｒ ｍａ ｋ ｌ ｎ ｒ ａ ｅ ＧＳ ｃ ｉｉｅ ｆｆ ｃｉ ａ ｅ ｖ ｓ ｏ ｈ ｅ ｓ ｙ ｅ ｕｔ ａ ｓ Ｔｈ ｅ ｄ ｐ ｏｅｎ ｃ ｎ ｅ ｔ ｅ ｒａｂｙ ｉｃ ｓ ｅ ａ ｔ ｔ ｓ ｏ ｕｎ ｏｎ ｌ ａ ｅ ｆｔ ｒ ｂ ａｎ ｃ ｌｖ ｒ ． ｅ ｓ ｅ ｒｔ ｉ ｔ ｎ ｖｉ ｔ ｌ ｅ ｏ ｉ ｏ
谷氨酰胺转氨酶 测定国标
谷氨酰胺转氨酶测定国标
谷氨酰胺转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，简称GPT）是一种重要的酶类物质，它广泛存在于人体肝细胞、心肌细胞和肌肉细胞中。
GPT的测定可以对肝脏的功能进行评估，因此被广泛应用于临床实验室中。
国标是指在特定国家或地区所制定的标准，用来规范各种检测方法、设备和结果的统一。
针对谷氨酰胺转氨酶的测定，各个国家或地区可能有不同的国标。
在中国，谷氨酰胺转氨酶的测定参考值常采用国家卫生健康委员会发布的《临床检验诊断标准》（GB/T 13793-2018）中所规定的参考值。
根据该标准，男性血清谷氨酰胺转氨酶的参考值为10-40 U/L，女性血清谷氨酰胺转氨酶的参考值为9-32 U/L。
需要注意的是，各个实验室和医院可能会根据自身的情况和经验，制定适用于本地区或机构的参考范围。
因此，在进行谷氨酰胺转氨酶的测定时，应该参考实验室或医院所提供的具体参考值。
硝酸还原酶活性测定
实验八硝酸还原酶活性测定一、目的硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和品质有影响。
因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。
通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。
二、原理硝酸还原酶能将NO3－还原成NO2－产生的NO2－的量与硝酸还原酶的活性相关。
通过测定反应液中产生的NO2－含量，即可确定酶活性大小。
NO2－含量可用磺胺显色法测定。
NO2－与磺胺及a－萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物其反应如下：酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示：亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。
三、实验材料、仪器和试剂1．实验材料植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片2．仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器（4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）试管（8）天平（9）三角瓶（50ml）3．试剂（1）亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容至100ml。
然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。
即为浓度5μg／ml的亚硝酸钠标准液。
（2）0.lmol·L－1pH7.5磷酸缓冲液（3）0.2 mol·L－1的硝酸钾溶液（4）1％对氨基苯磺磷酸（5）2％α－萘胺（6）30％三氯乙酸四、操作步骤1．标准曲线的制作操作项目管号1 2 3 4 5 6NaNO2淀标准液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 NaNO2含量（μg）0 2 4 6 8 10 磺胺(ml) 各4α－萘胺各4摇匀在30℃水浴中保温20分钟。
然后在520ml波长下比色测定消光值。
以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。
2．酶反应和酶活性测定将白萝卜叶片洗静，剪成0.5cm2h的小片，混匀后称三份，每份0.5－1.0g，分另放人50ml的三角瓶中，编号按下表加试剂摇匀，置真空于燥器中，抽气10分钟。
实验室生理生化指标实验简略步骤
叶绿素含量的测定(赵世杰2000，改进的方法)【仪器】分光光度计、电子顶载天平（感量0.01g ）、具塞试管、吸水纸、滴管、剪刀、试管18*3=54 【试剂】95％乙醇 【操作步骤】1.叶绿素的提取：取新鲜小麦叶片洗净，用滤纸擦干，去除中脉剪碎。
称取剪碎的新鲜样品0.05g ，放入20ml 具塞试管中，加入5ml 95%的乙醇 (塞上塞子，避光保存)，摇晃后避光浸提48小时，中间摇晃2-3次，上清液即为叶绿素提取液。
（重复2次）2.测吸光度：取叶绿体色素提取液1ml ，加95%的乙醇3ml 稀释后，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。
【结果计算】Ca=13.95OD 665-6.88OD 649Cb=24.96OD 649-7.32OD 665Cxc=（1000OD 470-2.05Ca-114.8Cb ）/245Ca 、Cb 、Cxc 分别为叶绿素a 、叶绿素b 和类胡萝卜素的总浓度，单位mg/L 色素含量（mg/g.FW ）)=）样品鲜重（稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（g /mg ⨯⨯L L可溶性蛋白质含量的测定（read 考马斯亮蓝G-250）【仪器】分光光度计、低温高速离心机、电子天平、研钵等、比色计、移液管、试管18*3=54 【试剂】（1）95%乙醇； （2）磷酸（85%，W/V ）。
（3）考马斯亮蓝G-250：称取0.05g 考马斯亮蓝G-250溶于25ml 95%乙醇中，加入85%（W/V ）磷酸50ml ，最后用蒸馏水定容至500ml （搅拌下过夜放置）。
此溶液贮存棕色瓶中，常温下可放置一个月； 【操作步骤】 1.样品提取：取小麦叶片洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，取0.1g 放入研钵中，加入1ml 蒸馏水冰浴研磨后定容至1.5ml ，在4o C 4000转/每分下离心15分钟，取上清液用于测定可溶蛋白含量。
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.02ml ，放入具塞刻度试管中（设3个重复管），加入5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min 后在595nm 下比色（1h 内稳定），记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒（Griess 显色法）说明书
硝酸还原酶（NR ）活性检测试剂盒（Griess 显色法）说明书微量法货号：BC4965规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件诱导剂储备液液体100 mL×1瓶4℃保存提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一液体5 mL×1瓶-20℃保存试剂二粉剂×2支-20℃保存试剂三液体6 mL×1瓶4℃保存试剂四液体6 mL×1瓶4℃保存标准品液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、诱导液：将诱导剂储备液用蒸馏水10倍稀释后使用，即取10 mL 诱导剂储备液加90 mL 蒸馏水，充分混匀。
现配现用。
2、试剂二：加入1mL 蒸馏水，-20℃分装保存，可以-20℃保存2周。
临用前用蒸馏水将试剂二稀释50倍，备用，即取10 μL 试剂二加入490 μL 蒸馏水混匀。
3、标准品：10 μmol/mL 亚硝酸钠标准溶液。
临用前将用蒸馏水标准溶液稀释100倍得到0.1 μmol/mL 的亚硝酸钠标准液，备用。
产品说明：NR （EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO 3ˉ +NADH+H ＋→NO 2ˉ+NAD ＋+H 2O 。
在酸性条件下，产生的NO 2ˉ能够参与重氮化反应生成紫红色化合物，这种紫红色化合物在540 nm 处有吸收峰，540 nm 下吸光值的变化即可表示酶活。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织前处理：（1） 取适量诱导液于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导液中（淹没即可），避光浸泡2 h ，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30 min ，取出样本，滤纸吸干。
硝酸还原酶活性的测定资料讲解
实验流程
标准曲线制作
试剂
1
2
3
4
5
亚硝酸钠标准液mlຫໍສະໝຸດ 0.20.40.6
0.8
1
蒸馏水ml
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1%对氨基苯 磺酸ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
0.2%ɑ-萘胺ml 4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
亚硝酸纳含量
μg
1
2
3
4
5
酶反应和酶活性的测定
取油菜叶洗干擦干
七、小组团队合作分工
一：李金婷 二：张翠敏，张翠敏 三：苏鑫 四——七：麻弘媛 汇总：麻弘媛
恶意放狗：麻弘媛 ヾ(o◕∀◕)ﾉヾ
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五、操作中存在的不足
1.待测样品研磨不充分导致的实验误差。 2.操作人员不同导致加入药品量的细微不同导致的实验误差。 3.不同人员对于颜色的辨别度不同导致的实验误差。 4.药品配制后放置时间过长部分变质导致的实验误差。 5.水浴加热时间不准确导致的实验误差。
六、提高准确度的方法
1.将样品剪碎充分研磨，尤其是叶片部分。 2.由同一人加入同系列药品。 3.让对颜色敏感的人辨别颜色的变化。 4.易变质药品现用现配，其他药品用完后盖好盖子。 5.水浴加热时利用秒表定好时间。
四、试验操作技能
1.在加液研磨实验材料时分次的添加冲洗研钵和研磨棒。 2.经离心后的样品上清须转移至试管中再进行吸取。 3.在测定样品OD值时所采用的对照试剂不同，标准曲线与Y轴的 交点也不同。 4.称量纸折叠至四边上翘，以防药品腐蚀天平。 5.试管夹夹在试管中上部，从试管 底部套入、取出，拇指不要按在试管 夹的短柄上。 6.在滴定时加液要慢， 边加边震荡使之充分反应。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶(NR)活性的测定主要采用光度法和荧光法。
光度法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条白色或透明的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入 Griess 试剂（硫酸铁铵与草酰胺的混合溶液）到每个孔中。
8. 在深色环境下，测量每个孔的吸光度值。
9. 利用吸光度值与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的吸光度值及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
荧光法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条黑色的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入荧光探针（如草酰胺二乙酸盐,DAF-FM DA）到每个孔中。
8. 在荧光酶标仪中，设置适当的激发波长和发射波长，测量每个孔的荧光强度。
9. 利用荧光强度与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的荧光强度及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
硝酸还原酶的测定
硝酸还原酶的测定试剂：1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100毫升，吸取5毫升用水稀释定容至1000毫升。
2、0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000毫升。
3、1% 对氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25毫升浓盐酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
4、0.2% α—萘胺溶液：称取0.2g α—萘胺溶于25毫升冰醋酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
5、30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸，水溶后定容至250毫升。
6、KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液：称3.03g KNO3溶于300毫升0.1mol/l 的磷酸缓冲液中，再加3毫升异丙醇混匀。
方法1、标准曲线的制作：取7支干洁的15毫升刻度试管按下表顺序加试剂，摇匀蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 摇匀4 4 4 4 4 4 4 摇匀1% 对氨基苯磺酸4 4 4 4 4 4 4 摇匀0.2% α—萘胺溶液每管含亚硝酸态0 0.2 0.1 0.8 1.2 1.3 2.02、酶反应和酶活性测定：①取样：将材料洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，剪成0.5-1.0平方厘米的小块，混匀后每个样品称0.5-1.0克3份，放入试管并编号。
②反应：向各试管中加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9毫升，其中一管立即加1毫升30%三氯乙酸溶液，混匀（作对照）。
然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。
将各试管置30度下于黑暗中保温30分钟，分别向处理管加1毫升30%三氯乙酸溶液，摇匀终止酶活性。
③：比色：将各试管静止2分钟吸取上清液2毫升加入另一组试管，分别加入1% 对氨基苯磺酸溶液4毫升和0.2% α—萘胺溶液4毫升，摇匀显色30分钟，以对照为空白，在540nm波长比色，并计算酶活性。
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硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定摘要本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。
关键词小麦硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶酶活性引言硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。
同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。
就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。
其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。
谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。
1、实验材料与方法1.1实验材料与试剂小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。
1.2实验原理1.2.1硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。
1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。
但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。
此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位为：A•mg-3(protein) •h-1。
1.3实验步骤1.3.1硝酸还原酶活性的测定1.3.1.1标准曲线制作取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。
摇匀后在30℃下水浴20min，然后在540nm下比色。
以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。
符号 1 2 3 4 5 6 7试剂（ml ）亚硝酸钠标准液蒸馏水1% 磷胺0.02%α-萘胺酶管含亚硝态氮（ug）0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.02.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.04.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.04.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.00.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.01.3.1.2硝酸还原酶活性测定植株预处理、取样、酶活性反应：先往对照瓶中加入1ml终止液，然后往3个瓶中均加入9ml反应液；混匀后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min（期间停顿几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底）；之后将各瓶在30℃、黑暗条件下静置反应30min；反应时间到，立即往两个测定瓶中加入1ml 终止液；将各瓶摇匀，再静置3min。
最后进行显色反应，根据标线求得亚硝态氮含量。
计算硝酸还原酶活性。
1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的测定1.3.2.1酶液的提取称取植物叶片1.0g，置于预冷研钵中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成匀浆，转移于寓心管中，在4℃下、15.000转离子20min，上清液即为酶液。
1.3.2.2谷氨酰胺合成酶活性测定取3支试管，分别加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入1.6ml反应混合液A（作为对照管），另外2支各加入1.6ml反应混合液B（作为反应管），混匀后，将3支试管均置于37℃水浴下反应30min；反应结束后，3支试管均立即加入1ml显色液，摇匀，静置片刻后，取上清液在540nm 处测定吸光值（用酶液提取液调零），根据吸光值计算酶活性。
1.3.2.3酶液中可溶性蛋白含量测定（采用紫外吸收法）取酶液0.3ml，用蒸馏水定容至100ml，分别在260nm和280nm下测定吸光值（用蒸馏水调零），根据公式计算酶液中可溶性蛋白含量。
2、实验结果与分析2.1硝酸还原酶活性的测定2.1.1标准曲线的测定以及硝酸还原酶活性的测定图1 标准曲线2.1.2样品活性的测定通过实验得出对照管，测试管1，测试管2的吸光值（表1）。
表1硝酸还原酶的吸光值1 2 3 平均值对照管0.005 0.015 0.009 0.0097 测试管1 0.039 0.016 0.029 0.028 测试管2 0.031 0.035 0.036 0.034通过以上的数值代入标准曲线中可以得出硝酸还原酶含量，即硝酸还原酶的活性（表2）。
表2 不同管内亚硝态的量编号亚硝态氮的量 P≤0.5对照管0.318 a测试管1 0.629 b测试管2 0.764 c 通过以上的数据统计，可以得出亚硝态氮的量，即为硝酸还原酶的活性，从实验的结果来看，实验管和对照关差异显著，实验前测试管用硝酸钾处理，小麦中硝酸还原酶明显增多，硝酸还原酶的活性明显增强。
2.2谷氨酰胺合成酶活性测定以γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物在540nm波长下的吸光值（表3）。
表3 540nm波长下的吸光值1 2 3 平均值对照管0.558 0.596 0.620 0.591 测试管1 0.806 1.002 1.018 0.942 测试管2 1.328 1.096 1.115 1.179 可溶性蛋白利用紫外吸收法测定，通过测定在不同波长下溶液的吸光值，然后利用公式进行计算，根据公式可以算出（表4）：可溶性蛋白的含量=1.55A280-0.76A260表4 可溶性蛋白的含量编号可溶性蛋白的含量 P≤0.5对照管0.053 a测试管1 0.089 b测试管2 0.101 c由表3和表4得到的数据可以代入以下公式，计算得出谷氨酰胺合成酶的活力（表5）：通过测定谷氨酰胺合成酶在540nm吸光值和粗蛋白质的含量，通过公式就可以计算出谷氨酰胺合成酶活性，计算公式常用的是：GS=A/（P*V*T）在上面的公式中：A为540nm波长下的吸光值；P为可溶性蛋白的含量；V为反应体系中加入的酶量；t为反应时间（h）。
表5 谷氨酰胺合成酶的活力编号谷氨酰胺合成酶的活力 P≤0.5对照管0.319 a测试管1 0.322 b测试管2 0.337 c通过试验结果表明，三个实验试管中谷氨酰胺合成酶的活力之间差异性不显著，说明了植株体内的谷氨酸含量不是很高，很可能与实验前的处理时间长短有关系。
3、讨论硝酸还原酶(NR)是陆生植物氮代谢的关键酶之一, 它将进入植物体内的NO3-还原为 NO-2, 进而在亚硝酸还原酶的作用下还原为氨进入氮的同化。
因此,NR 活性直接影响植物对土壤中硝态氮的利用能力。
生产中, 硝酸还原酶活性可作为农作物氮肥形态选择的重要依据, 也被认为是作物氮高效的育种选种指标之一[3,4]。
GS 在氮同化过程中起着十分重要的作用 , GS 也是分子生物学研究基因专一性表达和时空表达调控的好模式 ,所以成为人们研究的热点之一 ; 同时它的表达既受环境因素 ,如 CO2 、光、 NaCl 浓度等的影响 ,又受到发育因子的影响 ,因此 ,也是植物逆境生理研究的重要内容之一[5]。
在硝酸还原酶活性测定中，抽真空后不能见光是因为酶对反应条件很敏感，可能在光照的条件下就失活，另外，硝酸会见光分解。
实验前充分光照是使小麦的酶活性达到最大值。
空白对照的目的在于有一个在同样条件下结果的对比。
谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。
此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰。
在试验中测得可溶性蛋白的含量，利用公式即可算出谷氨酰胺合成酶的活力。
随着氮代谢相关基因研究的进一步深入，与植物氮素营养反应相关的基因更为明确，利用基因表达差异进行植物氮营养的早期检测，将为更加准确、及时地进行肥料运作提供科学依据。
参考文献[1] 陈薇, 张德颐.植物组织中 NR 的提取、测定和纯化.植物生理学通讯, 1980(4):45-49.[2]李常健,林清华,张楚富.高等植物谷氨酰胺合成酶研究进展.生物学杂志 ,2001,18(4):1-3.[3]刘亚丽,赵喜婷. 教学实验中硝酸还原酶活性测定方法的改进.植物生理学通讯, 2006,42(3):502 .[4]张涛,陈云,谢虹,等.硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展.广西植物,2004 ,24(4):367-372.[5]印莉萍,刘祥林,柴小清,等.不同浓度的氮源对小麦离体叶谷氨酰胺合成酶及其相关酶的影响.首都师范大学学报（自然科学版）,1997,18(2):34-40.。