链霉菌操作手册
发酵工程制药实验-链霉菌发酵
实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
链霉菌HU2014的应用、生物基土壤修复剂及制备方法
链霉菌HU2014的应用、生物基土壤修复剂及制备方法技术领域[0001]本发明涉及土壤修复剂技术领域，具体为一种链霉菌HU2014的应用、生物基土壤修复剂及制备方法。
背景技术[0002]许多报告表明，重金属通过降低叶绿素含量、损害呼吸链功能以及限制污染土壤中抗氧化酶的活性来阻碍植物生长。
其中六价铬Cr(VI)的可溶性高，使其迅速被其他生物吸收，产生生物毒性；而Cr(III)在中性pH下难以溶解，因此不具有生物可利用性。
因此，将六价铬Cr(VI)转化为Cr(III)，是一种有效的土壤修复途径。
[0003]目前对于重金属土壤污染的修复技术包括物理修复、化学修复、植物修复、微生物修复、联合修复等。
传统的物理修复方式工程量大、成本高、而且难以应用到大面积的土壤修复治理中；化学修复的操作过程相对复杂，同时会破坏土壤结构，导致土壤肥力下降，可能存在二次污染；植物修复因其成本低廉，不存在二次污染，是一种绿色环保的土壤重金属污染修复技术，但其存在生物量小、生长周期长等弊端，单一的植物修复很难达到理想的效果。
采用微生物吸附去除转化重金属己成为一个新兴的、环境友好且不引入二次污染的技术。
因此可利用微生物修复被六价铬Cr(VI)污染的土壤。
发明内容[0004]鉴于上述问题，本发明提供了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的链霉菌HU2014的应用、生物基土壤修复剂及制备方法，能够用于修复土壤Cr(Ⅵ)重金属污染，有效改良土壤理化性状，保障粮食品质和产量。
[0005]具体地，本发明提供了一种链霉菌HU2014(Streptomyces sp.HU2014)，用于修复重金属铬污染的土壤，以及用于制备生物基土壤修复剂。
[0006]本发明还提供了一种生物基土壤修复剂，包括以下质量份数的成分：微生物菌粉5‑30份、生物质碳10‑20份、无机氮3‑10份、无机盐2‑5份。
[0007]可选地，所述微生物菌粉包括链霉菌HU2014(Streptomyces sp.HU2014)和硅藻土，链霉菌HU2014与硅藻土的质量比为1:(5‑15)。
链霉菌亚甲蓝染色法实验报告
链霉菌亚甲蓝染色法实验报告实验：链霉菌亚甲蓝染色法实验一、实验目的：1.了解链霉菌的形态特征；2.掌握链霉菌亚甲蓝染色法的操作步骤；3.观察链霉菌在显微镜下的染色效果。
二、实验原理：链霉菌是一种常见的革兰氏阳性细菌，其形态特征为在培养基上形成长而曲折的链状菌丝。
链霉菌亚甲蓝染色法是一种常用的染色方法，用于观察链霉菌的形态结构。
该方法利用亚甲蓝染料，将链霉菌染色后，在显微镜下观察其形态特征。
三、实验材料与方法：1.实验材料：（1）链霉菌培养基；（2）链霉菌培养物；（3）亚甲蓝溶液（0.5%）；（4）显微镜；（5）玻璃片。
2.实验步骤：（1）取链霉菌培养物，加入适量的生理盐水进行稀释，制备菌液。
（2）取一片玻璃片，用酒精消毒并晾干。
（3）滴取一滴链霉菌菌液于玻璃片上，用火焰消毒的针头将滴液均匀涂抹于玻璃片上。
（4）将涂有链霉菌菌液的玻璃片，放置在亚甲蓝溶液中浸泡5分钟。
（5）取出玻璃片，用水冲洗干净。
（6）将玻璃片放在显微镜下，使用100倍的镜头观察链霉菌的形态结构。
四、实验结果：在显微镜下观察到的链霉菌呈现为一条条长而曲折的链状菌丝，菌丝之间相互交织，形成复杂的网络状结构。
链霉菌染色后呈现为蓝色，菌丝清晰可见。
五、实验讨论：链霉菌亚甲蓝染色法是一种简单而有效的染色方法。
亚甲蓝是一种碱性染料，具有较强的亲和力，能够与链霉菌细胞壁上的负电荷结合，使菌丝呈现出蓝色。
这种染色方法可以清晰地显示链霉菌的形态结构，有助于对其生长特征和菌株的鉴定。
在本实验中，我们观察到链霉菌在显微镜下的形态结构，即长而曲折的链状菌丝。
链霉菌的菌丝之间交织在一起，形成了复杂的网络状结构。
这种形态特征是链霉菌的重要鉴定特征之一，可以用于区分链霉菌和其他细菌。
六、实验总结：通过本次实验，我们了解了链霉菌的形态特征，并掌握了链霉菌亚甲蓝染色法的操作步骤。
链霉菌亚甲蓝染色法是一种常用的染色方法，能够清晰地显示链霉菌的形态结构。
通过染色后的链霉菌菌丝呈现出蓝色，使其在显微镜下更容易观察和鉴定。
实验室常用生化试剂配方
实验室常用生化试剂配方1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版）抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml) 10025(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 3525(0.15M NaOH配) 50(DMSO配)50 50MM使用终浓度（μg/ml）链霉菌2CMYEME大肠杆菌LA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMPAmpicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprimcat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph－* 10 10 2 5 10 5 100 10－－ 25 25 20 25 10 － 50－－－－－－ 2.5 － 550-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30注意事项：(1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装；（2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并设置阴性对照；（3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。
有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio（4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易挥发，有剧毒；（5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存；（6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整；(7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂对自身的损伤及对工作环境的污染。
《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》
《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》一、引言稻瘟病是一种对水稻生产造成严重威胁的病害，而链霉菌因其抗稻瘟病菌活性被广泛研究。
为了有效应对稻瘟病病害，本文通过深入研究，成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
二、材料与方法（一）材料本实验所使用的材料包括：稻瘟病感染的水稻叶片、土壤样品、培养基等。
（二）方法1. 链霉菌的分离与纯化采用涂布法在选择性培养基上分离链霉菌。
经过多次划线纯化，得到纯种链霉菌。
2. 链霉菌的鉴定通过形态观察、生理生化试验及分子生物学方法（如16S rRNA基因序列分析）对链霉菌进行鉴定。
3. 接合转移方法的建立采用原生质体接合转移技术，通过电击等方法诱导链霉菌原生质体的形成，然后进行DNA的接合转移。
三、实验结果（一）链霉菌的分离与纯化经过多次尝试和优化，成功从稻田土壤中分离出链霉菌ⅠT2和ⅡW1两个菌株，并在选择培养基上纯化。
（二）链霉菌的鉴定通过对ⅠT2和ⅡW1菌株的形态观察、生理生化试验及分子生物学方法鉴定，确认其均为链霉菌属。
其中，ⅠT2和ⅡW1菌株具有抗稻瘟病菌活性。
（三）接合转移方法的建立我们成功建立了链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的接合转移方法。
通过原生质体接合转移技术，实现了DNA的高效接合转移。
其中，电击等物理方法被证明能够有效地诱导原生质体的形成。
通过多次实验，我们优化了接合转移的条件，提高了接合转移的效率。
四、讨论本研究成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
这为进一步研究链霉菌的生物学特性及其在稻瘟病防治中的应用提供了重要的基础。
在链霉菌的分离与纯化过程中，我们采用了多种方法进行优化，以提高分离纯化的效率。
在鉴定过程中，我们不仅进行了形态观察和生理生化试验，还采用了分子生物学方法进行鉴定，以确保鉴定的准确性。
此外，我们还研究了不同因素对接合转移效率的影响，为提高接合转移效率提供了重要的参考依据。
LMJS培训-链霉菌遗传操作和PCR-TARGETING-Sep2011
apramycin, thiostrepton, kanamycin/neomycin, Streptomycin/spectinomycin, hygromycin Spores >108 cfu/plate
5. Donor-recipient ratio
6.Cell concentration, >108 cfu/plate
E.coli-Streptomyces intergeneric conjugation ( 3 ) Overlay/Flood When? 12-16 h Antibiotics and concentration
Gene replacement in Streptomyces
WT chromosome
Double crossover
R1
Gene replacement
plasmid
R2
Mutant chromosome
R1
How to construct a gene knockout in Streptomyces ?
Selection markers: aac(3)IV, tsr, neo, aadA, hyg Counter-selection marker: codA, sacB
Kieser T, et al. 2000. Practical Streptomyces genetics
质粒名称
链霉菌 复制子
抗性 基因
抗生素 （大肠杆菌）
抗生素 （链霉菌）
链霉素诱变育种的方案
• 2.菌丝过滤法
• 适用于真菌和放线菌 • 作用于丝状菌的孢子 • 3.高温杀菌法
• 适用于芽孢菌类
• 作用于芽孢菌类的芽孢和营养体
（三）、检出营养缺陷型
① 夹 层 培 养 法
② 限量补充培养法
③ 影印接种法
④ 逐个检出法
1.夹层培养法（延迟补给法）
2.限量补充培养法
3.影印接种法
• 需要注意两点
• 第一 防止菌落扩散和蔓延，在培养基中加入脱氧 胆酸钠 • 第二 为了克服孢子扩散而带来不纯现象，在操作 方法上改进。
4.逐个检出法
（四）、营养缺陷型的鉴 定
• 1 、鉴定方法
• 一种方法是加入一种物质测定多株缺陷型菌株 • 一种方法是测定一种缺陷型菌株对许多生长因子 的需求情况称为生长谱法
（一）、营养缺陷性的诱 变
筛选根据主次分为初筛和复筛
• 初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。 • 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离， 选育高产或其他优良菌株。 • 多级水平筛选：由于诱变产生高产突变株的频率很 低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中 常用多级筛选，一利于优良菌株的获得
（一）、初筛
• 平板菌落预筛 • 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行 筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提 高筛选工作效率。 • 摇瓶发酵筛选 • 优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条 件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。 缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑 取少，很难筛选到理想的突变株
（三）、影响诱变效果的因素
• （1）菌种遗传特性 • 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一 • 样。 • （2）菌体细胞壁结构 • 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 • 入细胞。 • （3）环境条件的影响 • 环境条件的影响包括： • ①诱变前预培养和诱变后培养 • ②温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
印片法链霉菌实验报告
印片法链霉菌实验报告
实验目的：
本实验旨在研究印片法对链霉菌进行分离和鉴定的效果，为链霉菌的研究提供实验数据和参考。
实验材料：
1. 链霉菌培养基
2. 无菌培养皿
3. 恒温培养箱
4. 实验室常用器材和试剂
实验步骤：
1. 准备工作：将链霉菌培养基培养至适宜的生长状态，确保培养基无污染。
2. 取一块无菌的培养基，倒入培养皿中，并均匀摊开。
3. 取一支火针，在火焰中消毒并冷却后，将其沾取链霉菌培养液的菌落，然后将其均匀涂抹在培养基上。
4. 用无菌的铁环或火针，在链霉菌菌落上进行串联接种，即将链霉菌菌落划过培养基表面，使菌落由密集到稀疏排列。
5. 将培养皿盖好，置于恒温培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间，通常为24-48小时。
6. 观察菌落生长情况，并记录其形态、颜色、直径等特征。
7. 根据菌落的形态特征，进行初步的链霉菌鉴定。
8. 如有需要，可进行进一步的生化实验或分子生物学实验，以确认链霉菌的鉴定结果。
实验结果：
根据实验观察，链霉菌在培养基上形成了典型的菌落，呈现出特定的形态和颜色。
菌落直径在一定范围内，具有一定的变异性。
初步鉴定结果表明，该菌落为链霉菌。
实验结论：
本实验通过印片法成功分离和鉴定了链霉菌。
印片法是一种简单、快速且有效的方法，可用于微生物的分离和鉴定。
该实验结果可为链霉菌的进一步研究提供参考和基础数据。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。