小鼠成纤维细胞原代培养
新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立
Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｔ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ｎ ０ ６ ３ ０ ０ ０ ， Ｈ ｅ ｂ ｅ ｉ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｍ ｙ ｏ ｆ ｉ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｓ ， ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ・ ｓ ｍ ｏ ｏ ｔ ｈ ｍ ｕ ｓ ｃ ｌ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ（ ０ 【 一 Ｓ Ｍ Ａ ） ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ —
［ 关键词 】 成纤维 细胞 ； 原代培养 ； 肌成纤 维细胞 ［ 中图分类号 】 Ｒ ８ １ ３ ． １ １ 【 文献标 志码 】 Ａ
【 文章 编号】 １ ０ ０ ８ — ８ １ ９ ９ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ － ０ １ ２ ９ － ０ ４
Ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｕ ｓ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｌ ｕ ｎ ｇ ｉ ｆ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｎ ｅ ｗ ｂ ｏ ｒ ｎ ｒ ａ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ａ ｍｙ ｏ ｉ ｆ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ
原代培养鼠肺成纤维细胞中_平滑肌肌动蛋白的表达
*基金项目:内蒙古医学院科技研究重大项目资助(NY2005ZD007)收稿日期:2008 01 28;修回日期:2009 04 13作者简介:杨敬平(1964 ),男,河南唐河人,医学硕士,主要从事呼吸与危重症医学研究。
通讯作者,E mai l:yangron@.c n原代培养鼠肺成纤维细胞中 平滑肌肌动蛋白的表达*杨敬平,孙德俊 ,李姝楠,高 丽(内蒙古医学院第三附属医院呼吸与危重症科,内蒙古包头014010)摘要 目的:观察原代培养大鼠肺成纤维细胞(FB)中 平滑肌肌动蛋白( SMA )的表达情况。
方法:24只雌性Wistar 大鼠,随机分为正常组和模型组,气管内注入博莱霉素A2(B LM A2)(5mg/kg)建立大鼠肺间质纤维化(PF)模型,正常组气管内注入等量生理盐水。
实验周期第28d 腹主动脉放血法处死,肺组织HE 染色和透射电镜检查。
体外原代培养FB,传3~5代后流式细胞术检测 S MA 表达的细胞阳性率。
结果:HE 染色28d 模型组大片肺泡结构破坏,肺泡腔消失,有成纤维细胞灶形成,电镜观察肺组织超微结构发生改变,肺间质中可见胞浆内有微丝样结构的MF 。
流式细胞分析结果:正常组 SMA 表达的细胞阳性率为95.5% 4.68%,模型组 S MA 表达的细胞阳性率为96.2% 2.14%,与正常组相比P >0.05。
结论:原代培养的大鼠肺FB 中 SMA 的阳性表达率正常组和模型组均显著增高,体外培养的大鼠肺FB 传3~5代后可能有部分已经转化为肌纤维母细胞(MF)。
关键词: S MA;成纤维细胞;原代培养;表型转化中图分类号:R563 文献标识码:A 文章编号:1000 6834(2009)03 339 05成纤维细胞(fibroblasts,FB),尤其是肌纤维母细胞(myofibroblasts,MF)的增殖和转化在肺纤维化中的致病作用是目前肺纤维化的研究热点之一,但是MF 具体如何转化以及转化的量的多少仍然是有争议的。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
糖尿病心肌病小鼠心肌成纤维细胞miR-375表达及其对胶原蛋白Ⅰ合成的影响
糖尿病心肌病小鼠心肌成纤维细胞miR-375表达及其对胶原蛋白Ⅰ合成的影响黄燕;张赢予;王好;周艳芳;张国辉;芮涛【摘要】目的:探讨miR-375在糖尿病心肌病心肌纤维化发生发展过程中的作用机制.方法:原代培养小鼠(C57BL/6)心肌成纤维细胞,采用免疫组织化学染色法鉴定细胞纯度.将培养的第2～3代心肌成纤维细胞随机分成对照组和高糖组,高糖组在处理6,12,24 h后,采用实时定量PCR方法检测各组细胞中miR-375的差异性表达.miR-375抑制剂瞬时转染心肌成纤维细胞,实时定量PCR检测转染效率.免疫组织化学染色检测心肌成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:原代分离培养的第2代心肌成纤维细胞纯度可达90％；心肌成纤维细胞经高糖处理6,12,24 h后其miR-375的表达有增加趋势；抑制miR-375的表达后,高糖处理的心肌成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达显著降低.结论:miR-375可能在糖尿病心肌病心肌纤维化中发挥重要的作用.%Objective:To investigate the effect of miR-375 on cardiac fibrosis in diabetic cardiomyopathy mice.Methods:Cardiac fibroblasts isolated from hearts of C57BL/6 mice were cultured in DMEM medium (low glucose concentration).The purity of cardiac fibroblasts were evaluated by immunohistochemical staining.The second and third generation cardiac fibroblasts were randomly divided into control group (5 mmol/L glucose)and high glucose group (25 mmol/L glucose).The cardiac fibroblasts of high glucose groups were treated by high glucose for different times (6,12,24 h).The different expression of miR-375 in cardiac fibroblasts was detected by real-time quantitative PCR.miR-375 inhibitor was transiently transfected into cardiac fibroblasts by lipofectamineTM2000 reagent; transfection efficiency was detected through real-time quantitative PCR.The expression of collagen Ⅰ in cardiac fibroblasts was evaluated by immunohistochemical staining.Results:The purity of the second generation of cardiac fibroblasts was above 90％.During the time point 6 to 24 h cardiac fibroblasts treated by high glucose,the expression of miR-375 showed an increase tendency;in high glucose and miR-375 inhibitor treated group,the expression of collagen Ⅰ decreased significantly.Conclusion:MiR-375 might play an important role in diabetic myocardial fibrosis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】5页(P197-200,206)【关键词】MiR-375;糖尿病心肌病;心肌纤维化【作者】黄燕;张赢予;王好;周艳芳;张国辉;芮涛【作者单位】江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002【正文语种】中文【中图分类】R542.23糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常见并发症，其临床诊断是基于糖尿病患者独立于冠心病、高血压和乙醇性心肌病等出现心功能不全［1］。
不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响
不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响作者：李盛，石汉平，孙冠青，孟锐【摘要】【关键词】创伤愈合成纤维细胞血糖应激反应Abstract： Objective To find the relationship between glucose concentration and the proliferation of fibroblast.Methods The proliferation of mouse fibroblast was tested in different concentration of glucose at 12h,24h,48h with CCK kit.The amount of the out cell type I collagen fibers was tested by the mouse type I collagen Elisa kit,and the expression of αsmooth muscle actin (αSMA) tested by immunochemistry.Results We found that under the medium of low concentration,the proliferation was much more than that in the high concentration groups after 12h,24h and 48h(P<0.01),namely the concentration was negatively correlated with the proliferation.We tested the out cell type I collagen fibers using the mouse type I collagen Elisa kit,but there was no difference between each group(P>0.05).About the expression of mouse αSMA,positive correlation was foundbetween the glucose concentration and the expression of the mouse αSMA.Conclusion At the original augmentation of the blood glucose,the proliferation of fibroblast is not different.But when it gets over a level,the proliferation will be depressed,which can lead to the delay of the healing of raw surface；the concentration of glucose has nothing to do with the out cell type I collagen fibers；the concentration of glucose is a factor which enhances the variation from fibroblast to myofibroblast,and the concentration of glucose is positively correlated with the tendency of the variation.Key words：wound healing;fibroblast;blood glucose;stress reaction在外科危重患者中常常遇到高血糖，其中主要是存在许多糖尿病患者，糖尿病损伤修复时，损伤组织的高糖环境对成纤维细胞的生长有着很大影响，使得创面愈合这一过程变得更为复杂。
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
⼈类⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法Primary human/mouse lung fibroblast isolation⼈类/⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法参考⽂献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)Materials:材料：1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,2.5mg/ml (HBSS);b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）2. Nylon filters 40/70 µm3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)4. Knife (disposable)5. Syringe6. PBSDigestion solution:Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)步骤：1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =1:4:5, 100ul/10g weight;称重⼩⿏后⿇醉2. Inject and wait 10min till the mouse sleep腹腔注射后等待10分钟3. Open abdomen and cut the artery of the kidney打开腹腔切断肾动脉4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white注射器灌注15ml PBS后插⼊⼼脏冲洗⾄肺部变⽩5. Take out the lung and heart in the tube with ice将⼼脏和肺取出置于冰盒中保存6. Wash with 80% ethanol in 10s在80%酒精中漂洗10秒7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)PBS洗3次，每次10分钟（⽼⿏），每次30分钟（⼈），清洗时保存于冰盒中8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1hours (shake vigorously every 15min)使⽤⼀次性⽆菌⼑⽚将组织切成⼩块，并加⼊消化液在37度⽔浴锅中静置1⼩时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm使⽤70微⽶过滤器过滤标本10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm使⽤40微⽶过滤器过滤标本12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching aconfluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使⽤为4-9代。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
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实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
该方法主要使用生物化学手段将较小体积得动物组织中妨碍细胞生长得间质加以分解、消化，使组织中结合紧密得细胞连接松散、相互分离，细胞失去与间质得连接,活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团得悬液，分散得细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。
胰蛋白酶主要适用于一些间质少、较软得组织如上皮、肝、肾与胚胎等，胶原酶主要适用于纤维组织、一些较硬得癌组织等得消化中。
原代培养最大得优点就是,组织与细胞刚刚离体，细胞保持原有细胞得基本性质，生物性状尚未发生很大变化，一定程度上更接近于生物体内得生活状态,可为研究生物体细胞得生长、代谢、繁殖提供有力得手段。
一般说来,幼稚状态得组织与细胞,如动物得胚胎、幼仔得脏器等更容易进行原代培养.2。
传代培养(subｃｕlｔure)就是原代培养细胞或细胞株在体外获得稳定大量同种细胞并维持细胞种延续得过程。
当原代培养成功后,培养得细胞通过增殖达到一定数量后,必需对细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种于新得培养瓶中，这一过程即为传代培养,亦称为继代培养或连续培养.如果原代细胞就是正常细胞,随着培养时间得延长与细胞不断分裂,形成得单层细胞汇合,细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另外，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，加之代谢物积累也不利于细胞生长或发生中毒。
此时，就需要将将培养细胞从原培养器中取出,加以分离,以1∶2或1∶3以上比率转移到另外培养器皿(瓶)内扩大培养,此过程称为传代（paｓｓage).原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中得细胞世系组成.细胞传代后一般经三个阶段:游离期;指数增生期与停止期。
培养细胞得“一代”就是指传代培养得累积次数,其与细胞世代或倍增不同，细胞转移扩大培养得1代中，细胞约能倍增3～6次。
细胞增殖得旺盛程度通常用细胞分裂指数表示，即细胞群得分裂相数/10０个细胞。
一般细胞分裂指数介于０、2%~０、5％,肿瘤细胞可达３～5％。
细胞接种2～3d时分裂增殖旺盛，就是活力最好时期,称指数增生期（对数生长期),适宜进行各种试验。
体外培养细胞与生长类型不同,传代培养得方法也不同。
贴附型生长得细胞要先进行消化，制成细胞悬液再传代;而悬浮型生长得细胞可直接传代,或离心后传代。
3。
细胞活力测定:在标准化培养与实验条件下，细胞数目及活力测定极其重要。
198３年Moｓmann首次应用ＭＴT比色法检测培养细胞活力。
MTT得化学名称为3—(４,5—二甲基噻唑-2)—２，5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝。
其具有接受氢原子而发生显色反应。
检测原理为,活细胞线粒体中得琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢,脱下得H+通过受氢体传递,能使外源性染料MTT还原为不溶性得蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中。
细胞中得蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜（DＭSO)中,并表现为一定得色度.用酶联免疫检测仪在４90nm波长处测定其光吸收值,并根据光吸收值得高低判断活细胞数量。
在一定细胞数范围内,光吸收值与活细胞数成正比．死细胞内酶失去活性,故无此功能.该检测方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济安全，具有良好得相关性。
广泛用于一些生物活性因子得活性检测、大规模得抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等．三、实验物品1．材料:乳鼠、、ＨｅLａ细胞(人宫颈癌细胞)。
2。
器材:超净工作台、解剖器材、酒精灯、离心管、移液管、吸管、烧杯、大平皿、96孔培养板、不锈钢滤网(100目、２00目)、水浴箱、血细胞计数板、培养瓶、ＣO２培养箱、离心机、盖玻片，擦镜纸，香柏油、倒置相差显微镜、显微镜、全自动酶标仪(ｂiｏ—rａd5５0型)。
3。
试剂:（1）75％乙醇（2)PＢS液（pH7、2）配方:Nacｌ 8ｇ、Kcl 0、2ｇ、Ｎa2ＨPＯ4 1、44g、KH2PO４0、24g 调pH ７、4 定容１Ｌ（3)无钙、镁离子PBS液(4)Ｄ—HanK液（无钙、镁离子得ＨanＫ液)(5)消化液(0、25%胰蛋白酶、0、02%EDTA各１份）（6)0、２5%胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶0、25g、D－Haｎks液100mｌ,pH7、4)（7)0、4％台盼蓝、(8）培养液:ＥMEM培养液(Ｅaｇle’ｓMinｉmｕm ＥsseｎtialＭedｉuｍEａglｅ氏最低要求培养基):ＥMEM8５份，小牛血清15份,加入青霉素、链霉素贮存液1份,使青霉素、链霉素得最终浓度分别为100单位及100 nｇ/ｍl．EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除茵。
4℃冰箱贮存。
DＭEM（Dulbecco’s Modiｆication of Eagle＇s Medium）:ＲPMI1640培养液(９0％RＰMI16４0、10%胎牛血清、双抗(青霉素,链霉素）100单位/ｍl7、4％NａHCO3调pH至6、8~7、0）RPＭＩ1640维持液（5%胎牛血清、余同上)（9)０、５%MTT 溶液(５ｍg/ｍｌ)、MTT 0、5g,溶于１0０ｍl得磷酸缓冲液（PBＳ),用0、22μm滤膜过滤以除去溶液里得细菌，放4℃避光保存两周内有效。
在配制与保存得过程中,容器最好用铝箔纸包住.最好现用现配。
（1０）二甲基亚砜（１1）碘伏四、实验步骤原代培养组织块培养法：1。
动物处死取新生大鼠(出生２~３天)一只，用颈椎脱臼法处死；为避免过多血细胞得干扰,也可采用剪断颈动脉放血得方法处死。
然后，把新生大鼠浸入盛有75%乙醇得烧杯中2-３秒,取出后放在大平皿中携入超净工作台。
2。
取材用碘酒与75％乙醇再次消毒一次，打开消毒器械包用镊子新生大鼠腹部皮肤,用解剖剪开腹腔，充分暴露腹腔;用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧得肾脏（右肾略低）;取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中。
（或取出肝组织置于培养皿中。
）3.剪切剪开肾膜,剥向肾门,去除肾膜及脂肪；用吸管吸取灭菌PＢＳ（或Hａnks液）将肾脏清洗３次,去除血污;将肾脏移入另一平皿中，沿纵轴剪开肾脏,剪去肾盂,用眼科剪将肾组织反复剪碎,直到剪成0、5~１mm3组织块;用吸管加2～3滴培养液轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中.（或肝组织用Hanks液反复冲洗，以除去血细胞,将肝组织移入另一个培养皿中,用吸管吸取0、5ml培养基置于肝组织上,用另一眼科剪将其剪成0、5~１ｍm３组织块。
) 4。
接种：用弯头吸管小心分次吸取组织块,使组织块吸在吸管端部,要避免吸得过高,组织块粘附于吸管壁而丢失。
将组织块均匀排布在培养瓶底部,控制组织块间距在０、5cm 左右，每2５ｍl培养瓶底可摆布15~20块．轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上,翻瓶时勿使组织块流动,加入2～3ｍl培养液（液层厚约１5mｍ)，塞好瓶塞,置CO２培养箱37℃培养2~３h,（勿超过4h）。
此时组织块略干燥，能贴附于瓶壁上。
５、培养：慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡附于瓶底得组织块,置培养箱中静止培养。
操作过程中动作一定要轻，减少振动，使培养液慢慢覆盖组织块，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。
6.观察24小时后取出观察，移动培养瓶时要尽量使培养液震荡撞击组织块。
在显微镜下观察已贴壁得组织块有无细胞长出。
消化培养法：１。
处死动物、取材及剪切:与组织块培养法相同.剪切后得组织块再用灭菌得PBＳ(或Haｎks液)清洗数次,直到PＢS澄清为止。
移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉到管底,弃上清。
2。
消化及分散组织块按组织块体积5~１0倍量，吸取0、25％胰蛋白酶－０、０2%ＥDTA混合消化液加到含组织块得无菌离心管中，与组织块混匀后，加盖无菌塞子密封,置37℃水浴中消化１0～２0min,其间每５min摇动一次,使组织块散开并与消化液充分接触．当组织块变得疏松、颜色略白时,从水浴中取出离心管，在超净工作台内静置后吸去含胰蛋白酶得上清(此步骤可以在8０0～1000rｐｍ离心3～5min去除含胰蛋白酶得上清）,加入2～3m ｌ培养液,终止消化.用吸管反复吹打,直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止。
最后将此细胞悬液用１00目、２00目得不锈钢滤网过滤至烧杯中。
3计数及稀释:从过滤得细胞悬液中取1mｌ，用血细胞计数板计数。
根据计数结果，用培养液稀释，稀释后得细胞密度以5×１0５~１×１0６为宜。
4。
接种培养:将稀释好得细胞悬液分装于培养瓶中,一般2５ml小方瓶分装4～5ｍｌ,青霉素瓶分装1ｍl。
培养瓶上做好标记,培养瓶盖旋紧后再松半个螺旋,置CO2培养箱在３7℃培养。
5.观察:接种培养后要每日观察培养液就是否污染、颜色变化及细胞生长状况。
培养液黄色且混浊表示污染,紫红色表明细胞生长不良,桔红色表明细胞生长良好.传代培养贴壁细胞得传代培养:1.准备从培养箱中取出原代培养细胞,在显微镜下观察，确认已长成致密单层、生长良好,适宜传代培养。