动物细胞与组织培养
动物细胞组织培养的原理
动物细胞组织培养的原理动物细胞组织培养是指把动物体内的某种细胞组织从体内取出后，通过一系列特定条件，在人工培养环境下维持其正常的生理代谢活动，使其细胞分裂生长，形成一定数量和质量的同质性细胞群。
细胞培养可以提供许多有益的信息，如细胞功能、基因表达、分子生物学和生物化学的信息等，因此被广泛应用于医学、疫苗制备、药物筛选及生物学研究领域。
组织培养的原理是建立在细胞生长、分裂、分化等基本生理现象的基础上，并遵循生物化学、细胞生物学等相关学科的理论，并强调理论与实践相结合的原则。
组织培养主要包括3个基本环节：细胞分离、无菌培养、细胞检查与鉴定。
下面分别进行详细介绍：1. 细胞分离细胞分离是组织培养的第一步，也是最关键的一步，决定了细胞生长及细胞群体的质量。
细胞的来源可以是新鲜组织或建立的细胞系。
组织分离后，需要进行消化，并选用合适的细胞培养基进行培养。
细胞的消化通常通过酶类的作用来完成。
不同的细胞类型需要不同的酶消化方法。
消化酶的种类、酶的浓度、消化时间等因素也会影响细胞分离的质量和效率。
2. 无菌培养细胞分离后，必须进行无菌技术处理，才能将其移入细胞培养器中进行培养。
在细胞培养的过程中，细胞必须保证一个良好的培养环境，包括正常的温度、低细胞密度、合适的营养和生长因子等条件。
细胞密度必须保持在合适的浓度，以避免背靠背的细胞引起的细胞死亡，同时保证细胞生长的速度与增殖，而且必须维持在同一浓度范围内。
营养液中的成分要具有必要的营养物质，如氨基酸、维生素、激素等。
对于一些需要特定培养条件的细胞，需要加入特定的生长因子和细胞因子，如白细胞介素、表皮生长因子等，以支持细胞的生长分裂和分化。
3. 细胞检查与鉴定在培养的过程中需要不断的对细胞进行检查和鉴定，如观察细胞的生长状态和数量，核形态和染色质形态的变化等，并对细胞特性进行检测和鉴定，如细胞的种类和分化状态，遗传学特征和分子特征等。
鉴定可以通过组织形态学、生物学特性、生化成分、免疫学特征、细胞遗传学等方面进行。
1 动物细胞与组织培养_细胞工程
1）恒定的温度:37 ℃
41
2）PH：7.2-7.４
• 当PH低于6或高于7.6时的生长会受到 影响，甚至死亡。
石蕊试剂用来检测PH的变化： 红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。 更精确的检测，PH计。
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3) 气体：
• 所需气体主要有氧气和二氧化碳。 • 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长 增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种 成分。 • CO2有调节PH的作用。 • 开放培养时一般把细胞置于95%空气加5% 二氧化碳混合气体环境中。
根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态 各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁 厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶 口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许 吸管伸入瓶内任何部位。
39
三、培养条件
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
• 【讨论】
多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论体外培养 细胞时需要提供哪些条件？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境， 无菌。
32
1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成 片、形成群落； 2、细胞胞质常伸出伪足和突起。 3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、 方向不规则。 4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。
33
（二）非附型细胞
• 悬浮生长细胞：血液白细胞、淋巴组织细
胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细
胞系等。
43
4）营养—培养基：
• 在保证细胞渗透压的情况下，培养液 里的成分要满足细胞进行代谢所需要的 各种营养，如包括十几种必需氨基酸及 其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水 化合物及无机盐类等。只有满足了这些 基本条件，细胞才能在体外正常存活、 生长。 • 动物细胞的培养基一般分为天然、合 成、此外细胞培养还需要一些常用的溶 液。
细胞工程-复习提纲-3.动物组织和细胞培养
━动物细胞的培养■ 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
★特性：■ 倍增时间长，生长缓慢，易受污染；■ 无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感；■ 细胞间主要以聚集体形式存在，大多数需要粘附在载体表面才能生长；■ 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
━接触性抑制：是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象，使得正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。
━密度抑制：细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。
但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，密度保持不变。
━动物大规模培养技术：悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等━原代培养：接种组织块直接长出单层细胞或组织分散成单个细胞在进行培养。
━传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养。
★常用细胞━组织工程：应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后移植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的。
━干细胞：一类具有自我更新和分化能力的细胞。
■ 根据功能分类：单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞；■ 根据来源分类分为：成体干细胞、胚胎干细胞（ES细胞）。
━干细胞增殖特性：①缓慢性②自稳性①缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。
而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，其增殖速度开始加快。
这种缓慢增殖的特点利于干细胞对特定的外界信号做出反应，以决定进行增殖还是分化程序。
缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性，使干细胞尽量避免产生自身突变。
②自稳性：自我更新维持自身数目的恒定。
━胚胎干细胞：ES细胞，是一种全能干细胞，是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
动物细胞培养
玻璃：最常用，便于观察、易洗涤可反复使
用。 塑料：常用聚苯乙烯，具亲水性，常加工成 多孔板、培养皿等 金属：不锈钢和钛
动物细胞小规模培养
悬滴培养法
培养瓶培养法 旋转管培养法
灌注小室培养法
培养板培养法
悬滴培养法 ①将培养液滴于盖玻
3、游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连
成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃 的游走或变形运动，速度快且不规则。此型 细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。 在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片 后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。 4、多形型细胞 形态上不规则，一般分胞体和胞突两部分， 其中胞突细长形，类似丝状伪足，胞体呈多 角形。
贴附型
培养细胞的 生长类型 悬浮型
游走型细胞 多形型细胞
贴附生长是大多数有机体细胞在体内生存和
生长发育的基本存在方式。贴附有两种含义： 一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外 基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必 须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满 表面后即停止生长，这时若取走一片细胞， 存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重 新布满创面。
贴附型细胞 1、成纤维型细胞 本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而 得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生 长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米 个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由 中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 2、上皮型细胞 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细 胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动， 处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生 物、 消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
动物细胞与组织培养
体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个 B 淋巴细胞产生 相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多 克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系 统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态 血清含一些对细胞产生毒性的物质 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠 性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产 中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部 分之一
体外培养细胞生存所需基本物质 （一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
细胞培养的常用液体 水 平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营 养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴 壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和 EDTA 溶液，胶原酶溶液 消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂 pH 调整液----NaHCO3 溶液，HEPES 溶液 抗生素液---青霉素，链霉素 谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
动物细胞组织培养及分类
生长特点
易相连成片 相靠—紧密相连—成
薄层—铺石状
生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单
个活动
成纤维细 胞样细胞
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似 的
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
正常细胞)
生长特点
排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而
单独行动 游离的单独的成纤维样细
胞， 常有几个伸长的细胞突起
贴附生长 型--类型
一．与体内同名的细胞不完全相同
○ 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源 ○ 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但
发展趋向不同
二．培养细胞的形态不稳定
○ 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附 于固相表面才能生存的细胞
01
添加标题
类型
02
添加标题
细胞在体内、外的粘附方 式：存在差异
03
添加标题
体内：粘附是全方位
04
添加标题
外形具有复杂的立体特征
05
添加标题
体外：多数情况，细胞只 有一个附着平面
06
添加标题
外形一般与体内时明显不 同
07
添加标题
按照培养细胞的主要形态， 可分为几大类型
1 分类
3 上皮样
5
其它，不定型
根据形态大致的不同，
2
主要2类：
4
成纤维细胞样
上皮样细胞 型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于- 来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
动物细胞组织培养(精)
将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然 后继续增殖。 这样的过程叫做传代培养
8、如何理解原代培养和传代培养？ 在第一培养瓶中培养就是原代培养，之 后转移到其它培养瓶中培养就是传代培 养 9、传代培养的细胞能一直传代下去吗？ 不都能 10、有些为何能一直传下去？ 发生突变，朝着癌细胞方向发展 11、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？ 保存10代以内的细胞，因为10－50部分 细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分 还发生突变向癌细胞方向发展
4、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮 液利于培养，使每个细胞与培养液接触
5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，因 为动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度 的提高而逐渐受到抑制
6、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再 分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时， 细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象 叫接触抑制。 7、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应 该怎样办？
?）
防止培养过程中污染 防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
(2)、培养基 成分： 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
种类： 天然培养基：主要取自动物血清，组织提取液，营 养价值高，成分复杂 合成培养基：人工配置，成分明确，便于控制试验 条件
和植物组织培养基相比有何独特之处？
液体培养基 、成分中有动物血清等
(3)、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 (4)、气体环境 O2和CO2
4.动物细胞生长特性：
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴 附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑 制。
动物细胞组织培养
?）
防止培养过程中污染 防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
(2)、培养基 成分： 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
种类： 天然培养基：主要取自动物血清，组织提取液，营 养价值高，成分复杂 合成培养基：人工配置，成分明确，便于控制试验 条件
和植物组织培养基相比有何独特之处？
液体培养基 、成分中有动物血清等
动物细胞培养
【例1】 回答下列有关动物细胞培养的问题。
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表
相互接触 面________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的 接触抑制。此时，瓶壁上形成的细胞层数是_____ ________ 。要 单层(或一层 ) 使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶 是________ 。 胰蛋白酶
(5)在细胞培养过程中，通常在________ 液氮) 的速率降低。
条件下保存细胞。
新陈代谢 因为在这种条件下，细胞中________ 的活性降低，细胞________ 酶
深度剖析
细胞增殖过程中存在接触抑制现象，需用胰蛋白酶处
理后再分瓶培养；在细胞培养过程中，部分细胞的遗传物质会发 生改变，会增加细胞分裂的次数；活细胞的细胞膜具有选择透过
4、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮 液利于培养，使每个细胞与培养液接触
5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，因 为动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度 的提高而逐渐受到抑制
6、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再 分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时， 细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象 叫接触抑制。 7、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应 该怎样办？
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动物细胞工程教学设计
【学习目标】
1、理解动物细胞培养的过程及条件
2、了解动物细胞核移植技术的原理
3、理解动物体细胞核移植技术克隆动物的过程
【课前知识点背诵】
一、动物细胞培养
1.流程：
2.条件：
(1)无菌、无毒：对培养液和所有培养用具无菌处理，添加一定量的抗生素，定期更换培养液以清除代谢产物。
(2)营养：除有机物糖、氨基酸、促生长因子和无机营养无机盐、微量元素外，加动物血清。
(3)适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2-7.4。
(4)气体环境：含95% 的空气加5% CO2 的混合气体。
CO2的作用是维持培养液的PH
3.应用：生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。
4.细胞遗传特性：
①10代以内：原代培养不变②10~50代：细胞株一般不变③50代后：细胞系改变
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
1.动物核移植概念
是将动物的一个体细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。
2.过程
3.应用
①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；②保护濒危物种；③生产医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植。
【课堂探究】
考点一：动物细胞培养
例1：实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。
下列叙述错误的是( )
A．甲过程需要对实验小鼠进行消毒 B．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化
C．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型D．丁过程得到的细胞具有异质性
探究讨论一：
1.为什么选择动物胚胎或幼龄动物的器官或组织进行动物细胞培养？
2.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？
3.两次使用胰蛋白酶的作用分别是什么？
4.多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中。
你认为体外培养细胞时需要提供哪些物质和什么样的环境条件？
5.培养动物细胞的培养基是液体培养基还是固体培养基？培养基中为什么要加入动物血清？
6.植物组织培养和动物细胞培养的比较
变式训练1：下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是
A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞
B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变
C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的
D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养
实战演练1：（2014年浙江卷）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是
A.连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型
B.某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞
C.由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆
D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状
巩固训练：如图表示动物细胞培养程序图，请据图回答下列问题：
(1)过程②表示________________。
(2)过程③和⑥用________处理组织或贴壁细胞分散成单个细胞，这样做的目的是______________。
(3)④和⑥的过程都要把分散的细胞制成_________________。
(4)过程⑤进行的细胞培养是________，细胞适于________生长增殖。
(5)过程⑦进行的细胞培养是________，一般传至________代后就不易传下去了，传至________继续培养时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，部分细胞的________会发生改变。
继续培养时，少部分细胞发生了________，朝着等同于________的方向发展。
考点二：动物体细胞核移植技术和克隆动物
例2：如图为某哺乳动物的生殖过程图，正确的叙述是( )
A．动物个体2为克隆动物，c为高度分化的体细胞
B．动物个体2的遗传性状与提供b细胞的母羊完全不同
C．产生动物个体2的生殖方式为有性生殖
D．e细胞为已完成减数分裂的卵细胞
探究讨论二：
1.为什么动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植？
2.动物体细胞核移植时选用卵母细胞作受体细胞的原因是什么？
3.试分析克隆动物遗传性状与其体内遗传物质构成具有怎样的关系？
4.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须
先去掉受体卵母细胞的核？
5.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，
想一想，这是为什么？
变式训练2：随着科学技术的发展，人们可以根据需求来改
造生物的性状。
如图是利用奶牛乳汁生产人类血清白蛋白的图解，据图回答问题：
(1)在此过程中涉及到的细胞水平现代生物技术手段主要有_________________________________。
(2)在基因工程中，我们称②为______________，在②进入③之前要用______________等工具来构建基因表达载体，能实现②进入③的常用方法是___________________________。
(3)图中①一般经______________处理可以得到③，从③到④的过程中一般利用去核后未受精的卵细胞作为受体，而不用普通的体细胞，原因是_______________________________。
(4)⑦是⑥的后代，那么⑦的遗传性状和最相似，原因是_____________________________。
如果②的数量太少，常用__________来扩增。
要实现⑦批量生产人类血清白蛋白，则要求③的性染色体是________，利用该方法得到的动物叫做_____________________________。
《动物细胞工程》教学反思
这是人教版选修三专题2的内容，在高考试题中，生物选修内容占15分之多，且大多以概念性的内容为主。
故我对这部分内容的处理是交给学生，以小组合作的形式进行复习。
一、教学成功之处
在教学过程中,始终注意面向全体学生,有意识的激发和引导学生主动参与探讨问题。
通过阅读教材，培养学生的自学能力，归纳能力和语言组织表达能力，使基础知识落实;通过对动物细胞培养、动物细胞核移植的相关问题的合作探究，培养学生归纳、分析、综合的思维能力。
1、以问题为载体，激发学生探究的欲望。
设计一个接一个的问题，以问题来驱动学生的学习需要，激发学生的求知欲。
2、强化过程训练，使学生逐渐学会探究的方法。
学生进行探究,不仅在于掌握生物学知识本身,更重要的是去体验和领悟科学家的思想,观念和科学研究的方法。
3、倡导自主、合作、探究的学习方式。
教师提出具体的值得探讨的问题与相关的背景材料，让学生逐步养成获取和处理科学信息的能力，分析和解决问题的能力，以及交流与合作的能力，让学生学会自学。
通过师生互动、对话、激趣设疑、探索疑难，有效促进学生思维力的发展。
人人参与的小组讨论，增加了学生动口、动脑的机会，有助于树立学生的自信心。
同时，学生能从多个角度多向思维，逐步培养学生勤于思考、勇于探索的习惯。
4、分层训练，面向全体学生，让每个学生都能体验成功的喜悦。
教学过程实现了知识题型化，考题知识化。
二、需要改进的地方
合作探究的问题时间长了一点，对重要问题探究的时间不充裕，不深入，不激烈。