固定化动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞大规模培养技术研究进展【摘要】当前动物细胞大规模培养技术已经成为生物技术领域的研究重点，同时被广泛应用于生物医药的研发、生产。
本文介绍了动物细胞大规模培养过程中的技术及研究进展。
【关键词】动物细胞；大规模培养技术；研究进展前言动物细胞培养出现在二十世纪初，并于1962年开始扩大，当前被广泛应用于生物、医学研究等。
依托动物细胞培养进行医用价值高的酶、疫苗、单抗、生长因子等的生产，已逐步发展为医药生物高新技术产业的一部分[1]。
当前依托动物细胞培养技术所制造生物制品在世界生物高技术产品市场份额中几乎占有一半的比例。
相关资料显示，生物技术药物属于新药开发的重要领域，在未来的制药工业中生物技术制药将成为重要新门类，上市的生物技术新药将高达数百种。
动物细胞大规模培养技术属于生物技术制药的重要环节，其水平当前集中于培养规模的扩大、细胞特征的改变等方面。
一、细胞生物反应器生物制品的生产离不开动物细胞的培养，其中生物反应器是进行动物细胞培养的重要设备。
因为动物细胞在生产红细胞生成素、尿激酶原、疫苗、干扰素等价值昂贵的生物制品时优势显著，所以关于动物细胞生物反应器的研制迅速。
（一）机械搅拌式这一类型的生物反应器开发相对早、应用也比较广泛，包括培养罐、阀、马达、管、泵、仪表。
在马达带动不锈钢搅拌系统可以对培养物进行混匀，罐顶的传感器连接监测培养物的pH值溶氧度、NH3、NH4+、温度、葡萄糖消耗等，规模为2000L，在微载体、灌注技术及多孔微球技术的配合下，其细胞密度将超过107/mL，消毒十分便利[2]。
培养的动物细胞类型多样、培养工艺易于放大、适宜于工厂化生产是其优势所在，但机械搅拌造成的剪刀力却会对细胞造成损害。
（二）气升式通过这一类型的生物反应器，气体混合物可以经底部喷射管到中央导管，这样中央导管的液体密度将比外部区域低，这就促成了循环。
其结构趋同于搅拌式，但是进行搅拌的不锈钢叶片换成了气流管，所以其形成的剪刀力较为温和，对细胞的损害相对较小。
固定化
固定化技术及其应用摘要固定化细胞技术是酶工程的核心技术之一，它将酶工程提高到一个新水平。
该技术简化了工业分离纯化的步骤，并使酶反应的连续生产成为现实。
目前，该技术已经广泛应用于食品、发酵、三废处理等行业，经济效益显著。
首先分析了固定化细胞的优缺点，介绍了近年来在食品、发酵和三废处理行业的应用，最后对其应用进行了展望。
关键词固定化酶；食品；发酵；三废处理；应用引言固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。
是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
【1】固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。
最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点【2】。
固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。
在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。
固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径, 相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯、对贴壁型和非贴壁型细胞【3】都适用的优点, 因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
酶作为一种蛋白质，其催化活性与空间结构密切相关，在大多数情况下固相酶的催化活性较低，以固定化氨基酰化酶为例，选择比较好的载体材料和固定化方法，其活性一般也仅为游离酶的50％～60％。
大规模动物细胞培养问题及对策
5结论与展望
可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。
大规模动物细胞培养的问题及对策
大规模动物细胞培养的问题及对策
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。
动物细胞的灌注养方法
动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比,动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题,大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术,提高动物细胞大规模培养的产率,一直是国内外研究的热点之一。
动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
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•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
大规模培养细胞技术
[9]张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺[J].华东理工大学学报,1998,24:659~663
[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus[J].App Biochem Biotechnol,1997,62:291~30
2.1.3
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
大规模
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
细胞固定化技术的研究进展
细胞固定化技术的研究进展
吴海亮 2008年1月
细胞的固定化是在固定化酶基础上发展起来
的一种高新技术和方法，是指利用化学或物理的 手段将微生物自然固定于限定的空间区域内，保 持其固有的催化活性，并能反复使用。固定化生 物细胞能持续增殖、休眠及衰亡，其活性始终保 持稳定。固定化的生物细胞除保持其原有的识别、 结合和催化活性外，还具有易于分离、可重复使 用及稳定性提高等显著的优点。
1.1 有载体固定化细胞
有载体固定化细胞是将动物、植物或微生物 细胞固定于合适的不溶性载体上，并应用于工业 化生产。
有载体细胞固定化技术不但可以提高生产效 率，延长细胞寿命，增加生产能力，而且在生产 后期易于进行细胞的分离和回收，因此在生产实 践中得到了广泛的应用。
夏黎明等人将1.2％的Al2 O3 添加在质量分数为2％ 的CaCl2 溶液中，形成机械强度较好、富有弹性、对糖 的利用率高和发酵眭能好的凝胶粒子，用以固定化休哈 塔假丝酵母(Candida shehatae)细胞，证实了采用固定 化增殖细胞发酵己糖和戊糖，固定化凝胶珠的稳定性强， 操作简便，发酵速度快，生产周期短，酒精得率高。
1959年，Hattori和Furusaka首次将大肠杆 菌F.col吸附在树脂上，实现了细胞固定化。 1973年，含有L一天冬氨酸酶的微生物被固定化， 并用于L一天冬氨酸的生产。20世纪70年代末， 动物、植物固定化细胞技术也得到了快速的发展。
1、细胞固定化方法
细胞固定化方法很多，杨文英等介绍了吸附 法等7种 制备固定化细胞的方法。成庆利等人同根据有无 外加载体，将细胞固定化分为有载体固定化和无 载体固定化。
1.2 无载体固定化细胞
20世纪80年代初，K．Ease等人率先提出利 用某些具有自身强絮凝能力的菌株形成颗粒，以 此作为一种固定化细胞的方法，即无载体固定化 细胞。无载体固定化细胞即微生物细胞絮凝，通 常指细胞在生长期间发生的无性凝集。
动物细胞培养技术的研究与应用
动物细胞培养技术的研究与应用随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也被广泛地应用于医药、生物学等领域。
作为一种重要的实验技术，在医学、生物学以及其他相关领域发挥着不可替代的作用。
本文将就动物细胞培养技术的研究与应用展开讨论。
一、动物细胞培养技术的基本原理动物细胞培养是将动物组织或细胞分离培养在营养液中的技术，这种方法可以使细胞脱离组织，在适当的营养环境中无限增殖，而不再受控制的细胞生长环境的限制。
由于动物细胞具有复杂的生命现象，因此在培养过程中要求细胞处于良好的生长环境下，如温度、营养、气体和水分等。
动物细胞培养技术主要包括原代培养、细胞的传代培养、冻存和解冻等过程。
其中，原代培养是指从动物组织或器官中直接分离得到的细胞，传代培养则是将原代培养得到的细胞继续培养。
而冻存和解冻则是为了保持动物细胞在长期保存期间的活力。
动物细胞培养技术的应用主要涉及到细胞研究和医学领域。
在细胞研究领域，它可以用于细胞遗传学、细胞生物学、细胞分子生物学、细胞生长和分化等领域的研究。
在医学领域，动物细胞培养技术可以用于药物研发、病毒研究、组织工程和干细胞研究等方面。
二、动物细胞培养技术的研究与发展自从20世纪50年代，人类对动物细胞培养技术的研究就已经开始。
当时主要是针对小鼠和人类的细胞进行培养。
后来，随着技术的不断发展和改进，动物细胞培养技术逐渐成熟，并广泛地应用于不同领域。
随着时间的推移，越来越多的细胞系被创立出来，也就是人们所熟知的各种细胞株。
在动物细胞培养技术的研究中，细胞表面和细胞固定化技术也是研究热点之一。
关于细胞表面控制技术，主要是为了研究细胞与其外界环境之间的相互作用，如细胞-蛋白相互作用等。
而细胞固定化技术则是为了使细胞固定在各种载体上，以便细胞在制药和环境领域中的应用。
此外，动物细胞培养技术还与其他研究领域相结合，如基因工程、蛋白质工程等。
总而言之，动物细胞培养技术的研究和发展是联系紧密的，不同领域的融合能够推进动物细胞培养技术的不断发展。
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固定化动物细胞大规模培养技术研究进展石 凯1 熊晓辉1 许建生2(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。
并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。
关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。
动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。
大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。
固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。
2 固定化培养方法在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。
但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。
由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。
故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。
2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统[2]。
该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。
反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。
通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。
这种结构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。
该系统可以连续化生产蛋白质。
由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。
而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。
增加套数即可实现放大。
2.1.2 微载体微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。
这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。
培养液中大量的收稿日期 2001-12-07;修改稿日期 2002-03-05。
第一作者简介 石凯(1977—),男,硕士研究生。
电话025-*******-3716。
・655・ 2002年第21卷第8期 化 工 进 展CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS微载体为细胞提供了极大的附着表面,1g微载体其比表面积可达6000cm2,从而可实现细胞的高密度培养[4]。
微载体的直径在60～250μm,由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成,如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等[5～7]。
由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性,在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质,因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。
Van Wezel当时选用的是阴离子交换树脂Sephadex A50培养动物细胞,其后Van Hemert、Spier及Whiteside也相继作了培养仓鼠肾细胞(BH K21)等细胞及生产口蹄疫苗的报道[8]。
采用微载体培养具有以下优点:①比表面积大,单位体积培养液的细胞产率高;②采用均匀悬浮培养,无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况;④细胞收获过程相对简单,劳动强度小;⑤培养基利用率高,占地面积小;⑥放大容易,国外已有公司以1000L规模培养人的二倍体细胞来生产β-干扰素。
但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞;接种密度高;微载体吸附力弱,不适合培养悬浮型细胞。
2.1.3 大孔微载体人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积,开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。
这一方法首先是在1985年由Verax公司开创的(Verax系列大孔加重胶原珠),其后出现了多种大孔微载体。
张孝兵等[9]将广泛使用的Verax流化床系统与常规传统大规模培养系统结果做了比较,发现Verax系统的细胞密度和体积产率比相应的常规培养高。
由于大孔微载体将细胞固定在孔内生长,因而与其他方法相比具有一系列优点:①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍;②细胞在孔内生长,受到保护,剪切损伤小;③与包埋法相比,传质尤其是传氧效果好[10];④两种类型细胞都适用;⑤细胞三维生长,细胞密度是实心微载体的10倍以上,有的可达108个/mL[11];⑥适用于长期维持培养,例如Verax流化床培养系统能维持培养100多天,细胞生长情况依然良好;⑦微载体浓度高,实心载体在培养液中浓度增大到一定时,细胞密度反而下降;而大孔微载体在浓度较高时,表面碰撞增加,能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。
因此有人预言,大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。
2.2 包埋将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。
此法步骤简便,条件温和,负荷量大,细胞泄露少。
因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护,细胞能抗机械剪切。
但该法也有一定缺点,如扩散限制,并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。
包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。
多孔凝胶是最常用的载体,用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。
2.2.1 海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀,然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠,分离洗涤后即可用于培养。
此法操作时条件温和,对活细胞损伤小。
但固定后机械强度不高。
为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞,国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用[12]。
2.2.2 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶可用二相法制得。
将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油),形成直径0.2mm凝胶珠珠,移去石蜡油后,细胞即可进行培养。
同海藻钙一样,琼脂糖更适于培养悬浮细胞。
尽管凝胶珠形成过程很复杂,目前放大体积不超过20L。
但琼脂糖凝胶无毒性,具有较大的空隙,可以允许大分子物质自由扩散,因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。
Mosbach等曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞L S21和淋巴细胞MLA144生产单克隆抗体和白细胞介素[13]。
2.2.3 血纤维蛋白将动物细胞与血纤维蛋白原混合,然后加入凝血酶。
凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,将动物细胞固定在其中。
血纤维蛋白可以促进细胞贴壁,因此两种类型的细胞都适于培养。
而且基质高度多孔,允许大分子物质的自由扩散。
但机械强度差,对剪切力很敏感。
2.3 中空纤维中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。
自从1972年Knazek等[14]首次报道该技术后,陆续已有许多关于用中空纤维系统培养・755・ 第8期 石凯等:固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 动物细胞的研究工作。
典型的封闭式中空纤维反应器循环系统[15]如图1所示。
系统的核心装置是中空纤维反应器,里面封装了一束中空纤维将整个反应器内腔分为毛细管外空间(extracapillary space ,ECS )和内腔空间(lumen space ,LS )。
培养细胞接种到ECS 中,培养液和氧气灌注到纤维管中,依靠蠕动泵的推动在系统中循环,并通过扩散作用从LS 提供给细胞[16]。
图1 封闭式中空纤维反应器循环系统示意图这种柱状反应器的不足之处是营养供应和细胞代谢产物存在浓度梯度,因而细胞分布不均,培养贴壁细胞时不能扩展成单层。
为此,Feder 等[17]开发出将纤维管束横放的平板式浅床中空纤维反应器(flat -bed hollow fiber bioreactor )。
将若干层浅床组合在一个反应器中,床层深度相当于3～6层纤维管,为使培养液分布均匀,在床层两端安装了2μm 微孔的分布器。
中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入,使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。
缺点是膜的污染和堵塞,观察困难,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维[18]。
中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长,以达到更高的细胞培养密度。
目前中空纤维反应器已进入工业化生产,主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体,如Bioresponse 和Invitron 公司利用这种反应器生产单克隆抗体[19]。
2.4 微囊化微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin 和Sun 创建的一种大规模培养技术[20]。
其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。
生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。
培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。
微囊工艺已生产出以克计的单克隆抗体[21]。
实验证明,采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,在7～27d 微囊内抗体浓度可达1250～5300mg/L [22]。
利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞,形成免疫隔离的人工细胞,以此植入疾病动物或病人体内。
由于微囊里外来的组织细胞分泌分子量小于11×104ku (u =(116605402±010000010)×10-27kg )的激素和介质等物质,可补充疾病体内缺乏的生理活性物质,从而达到治疗疾病的目的,并且不引起免疫排斥现象。