T—NHL TCRγ多重引物基因重排PCR参数优化
PCR常用优化略
PCR常用优化策略特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。
PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。
PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。
而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。
理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。
研究表明这三个参数都受到PCR 反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。
因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。
PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。
这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。
其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH 值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。
1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。
理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。
实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。
为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。
需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。
例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。
2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。
PCR反应程序设置哪些参数最重要
PCR反应程序设置哪些参数最重要PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列，从而在实验室中大量产生特定的DNA片段。
PCR反应的成功与否，关键在于合理设置PCR反应的各项参数。
本文将讨论PCR反应中最重要的参数设置。
引物设计PCR反应的第一个重要参数是引物设计。
引物是PCR反应中的两个短DNA片段，能够识别并结合到待扩增的目标DNA序列的两端。
引物的序列需要与目标序列高度特异性匹配，避免与其他非目标DNA序列发生非特异性扩增。
合理选择引物还需要考虑引物的长度、GC含量和互补性。
通常来说，引物长度应在18到25个核苷酸之间，GC含量应在40%至60%之间。
此外，引物的互补性也要避免引物之间形成二聚体或异聚体，影响PCR反应的效率和特异性。
温度参数温度是PCR反应中的另一个重要参数，包括Denaturation（变性）、Annealing（退火）和Extension（延伸）三个阶段的温度。
Denaturation阶段通常需要高温（通常为94℃至98℃）来使DNA双链解开成两条单链。
Annealing阶段需要将温度降低到与引物匹配的特定温度，使引物与目标DNA序列结合并引发扩增。
通常，合适的退火温度应在引物的Tm值（熔解温度）附近。
Tm值是指DNA的两个单链在一定条件下解开的温度。
Tm值的计算可以用公式Tm= 4 × (G + C) + 2 × (A + T)，其中A、T、G和C分别表示核苷酸A、T、G和C的数量。
Extension阶段需要较低的温度（通常为68℃至72℃），使DNA聚合酶结合在引物的3’端，并合成新的DNA链。
反应时间反应时间是PCR反应中确定的一个重要参数。
反应时间需要考虑参与PCR扩增的DNA模板的长度以及目标DNA的扩增比例。
通常情况下，PCR反应时间不宜过长也不宜过短。
如果反应时间过长，可能会导致非特异性扩增的发生，产生多个不需要的DNA片段。
PCR优化策略
PCR优化策略特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。
PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。
PCR的有效性是指经过相对较少的 PCR循环能获得更多的产物。
而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。
理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。
研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。
因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。
PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。
这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。
其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。
1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。
理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。
实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。
为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。
需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。
例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和 1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。
2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。
2 PCR 及反应条件的优化
三．PCR 操作
在一微量离心管中依次加入下列试剂：
DNA 模板
10PCR buffer（含MgCl2） dNTPs (10mmol/L) 5’引物 (10mol/L) 3’引物 (10mol/L)
1 l
5 l 1 l 1 l 1 l 50l
去离子水（补足反应体系）
Taq DNA pol. (2U/l)
Primers That Form Hairpins
• A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin.
• The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.
反应分三步：
① 变性（denaturation）； ② 退火（annealing）； ③ 延伸（extension）
pre-denaturation 95℃ for 5min;
Denaturation: 95℃ for 30~60s
Annealing: 37~68℃ for 30~60s extension: 72℃ for 30s~2min 72℃ extension for 10 min 30 cycles
5‟
at gaaatataca agt
gaagagca tcccagtaa
CTTCTCGTAGGGTCATT
下游(3‟ )引物的结合
5‟
3‟
上游(5‟ )引物的结合 at gaaatataca agt 3‟
答：5’引物照抄，3’引物互补倒读； 酶切位点加在引物的5’； 调GC含量的碱机放在最前边； 此外无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。 设计引物时: 5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同， 以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成; 3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互 补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。
PCR反应条件的优化
PCR反应条件的优化1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。
变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃1min。
在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
退火温度越高,所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。
退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。
pcr反应循环参数
pcr反应循环参数PCR反应是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、亲子鉴定等领域。
要想成功进行PCR反应，循环参数的设置至关重要。
本文将介绍PCR反应的循环参数，并提供一些建议，帮助读者正确设置PCR反应的参数，提高反应效率。
PCR反应循环参数包括：变性、退火、延伸。
下面我们分别来介绍这三个参数。
首先是变性参数。
变性步骤的目的是使DNA双链解开，变成单链。
通常情况下，变性温度在95℃左右，时间约为30秒到1分钟。
合适的变性温度和时间可以有效地解开DNA双链，为后续的扩增提供条件。
接下来是退火参数。
退火步骤是为了使引物与目标DNA碱基序列结合。
通常退火温度比变性温度稍低，一般在50-68℃之间。
退火时间一般为30秒到1分钟。
合适的退火温度和时间可以使引物与目标DNA准确结合，确保扩增的特异性和准确性。
最后是延伸参数。
延伸步骤是在特定的温度下，使DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。
延伸温度一般为60-72℃，延伸时间根据扩增片段的长度来确定。
一般每增加100-1000bp，推荐延伸时间增加30秒到1分钟。
适当的延伸温度和时间可以确保扩增产物的合成及扩增效率。
为了理解PCR反应循环参数的设置更具体，我们以一个典型的PCR 反应为例。
假设我们要扩增一段150bp的目标DNA片段，以下是一个参考的循环参数：1. 变性：95℃，30秒2. 退火：55℃，30秒3. 延伸：72℃，30秒以上的循环参数可能需要进行25-35个PCR循环，具体视实验需求而定。
当然，以上只是一个参考设置，不同实验可能需要进行调整。
在实际操作中，我们可以根据目标片段的大小、引物设计和模板DNA的特性等因素来灵活调整PCR反应的循环参数。
此外，一定要进行试验来优化循环参数，以提高PCR反应的效率和特异性。
综上所述，PCR反应的循环参数是影响反应效果的关键因素。
正确设置变性、退火、延伸参数，可以提高PCR反应的特异性和效率，从而获得准确和可靠的实验结果。
荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建
荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建江小工;徐兵;许文娟;李冰【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2004(020)002【摘要】目的:构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线,为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础.方法:对TCR VγI-¨基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针.提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒.结果:重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明TCRVγI-Jγ基因已成功克隆.以100～10-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增,Ct值分别为21.08、24.34、27.53、30.58和33.25.统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数为0.998.结论:所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好,准确可靠,利于统一标准.【总页数】3页(P115-117)【作者】江小工;徐兵;许文娟;李冰【作者单位】510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.实时荧光定量PCR检测鳜IgM mRNA标准品质粒的构建 [J], 刘雨果;潘厚军;陈偿;巩华;石存斌;吴淑勤2.荧光定量PCR检测TRECs的标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 李红兵;陈明;朱学文;汪莉萍;葛国洪;李秀华3.小尾寒羊瘦素长型受体基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 张桂山;徐晶;娄玉杰;张善鹏;姜怀志4.实时荧光定量PCR检测PrP基因表达标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 宁章勇;赵德明;杨建民;崔亚利;孟丽平;吴长德;秦秀慧;马李颖5.实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 张昌盛;王俊杰;李湘涛;翟红;刘群因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR体系优化(新)
H3
29.854
H4
0.000
10u/test 20u/test 30u/test 40u/test 50u/test NTC
RNA酶抑制剂浓度的优化
比较了四个浓度： 24 U/T 12 U/T 8 U/T 4 U/T
高浓度RNA
低浓度RNA
优化前后含量对比
成分
作用
上游引物 下游引物
探针
DNA正链扩增引物
CSD
Cambridge Crystallographic Data Center
引物的设计与筛选2
二级结构分析
条件： 42℃；50mM Na+; 2.5mM Mg2+
/~zukerm/rna/
引物的设计与筛选3
探针用量的优化
0.6uM 0.3uM 0.15uM
反应体系的优化1
不同Taq E的比较
Taq 1 Taq 2
反应体系的优化2
Taq E浓度的优化
0.5 U/T 2.0 U/T
1.0 U/T 3.0 U/T
反应体系的优化3
dNTP浓度的优化
10uM/T 40uM/T
20uM/T 80uM/T
Mg2+对荧光强度的影响
双色荧光PCR
FAM
JOE
不加内标（单色PCR) 加人内标 (双色PCR）
三色荧光PCR
FAM
HEX
Texas－Red
多色荧光PCR应注意的几个问题
1、反应原料问题
Taq E， d NTP ， 逆转录酶等
HBV
2、引物扩增问题
HVB HCV HIV
HIV
HCV
3、探针设计问题
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总体而言 ， 研究结 果表 明 ， 微增 加引 物浓度 可以改 善 轻 ＦＰ Ｆ Ｅ组织的 Ｔ Ｒ Ｃ 克隆性 Ｐ Ｒ检测 。实验性的调整 Ｐ Ｒ参 Ｃ Ｃ
注 ： 据 没 有对 应 关 系 ， 为 变 量 数 都
数对 Ｆ Ｐ Ｆ Ｅ组织的克隆分析 ， 可能会有很大的价值 ， 通过 Ｐ Ｒ Ｃ
ｓａ ｄ ｒ ｉａ ｉｎ ｏ ＣＲ ｆ ｍ ｎ ｒ ｔｃ ｌ ｏ ｅｅ ｔ ｎ ｏ ｌｎ ｌ ｔｎ ａ ｄ ｚ ｔ ｆＰ ｏ ｐ ｍｅ ａ ｄ ｐ ｏ ｏ ｏｓ ｆ ｒ ｄ ｔｃ ｉ ｆ ｃｏ ａ ｉ ｏ
１２ ２ Ｐ Ｒ （ ） 物 由上 海 生 物 工 程 公 司 合 成 。 引 物 序 ． ． Ｃ １引
列 参 照 文 献 ［ ］ 分 为 Ｔ Ｒ， 管 ： ＇ ｆ １。 Ｃ＇ ／ Ａ Ｖ， ＋ＶｙＯ＋Ｊ ｌ２＋ ／ １ ＇ ｌ ｐ／
Ｊ １ ２和 Ｔ Ｒ， －／ ， ／ Ｃ ． Ｉ Ｂ管 ： ＋Ｖ， １＋ ｐ ／ Ｖ ＇ ／ Ｉ ｊ ｌ ２＋Ｊ １ ２共 ２个 多 重 ￣／ ／
Ｉ ｍ ｙ ｂ ｆ ｒａ ｖ ｌｅｔ ａ ｊ ｓ Ｐ Ｒ ｐ ｒｍ ｆｒ ｂ ｘ ｅｉ ｅ ｔｆ ｅＣ ｏ ｉｇａ ａ ｓ ｆ Ｆ Ｅ ｔ ｓ ｅ ｔ ａ ｅｏ ｅ ｔ ａ ｄｕ ｔ Ｃ ａａ ｅｅｓ ｙｅ ｐ ｒ ｎ ｏ ｔ ｌ ｎ ｎ ｌ ｉ ｏ Ｐ ｉ ｕ ． ｇ ｕ ｏ ｍ ｒｈ ｎ ｙｓ Ｆ ｓ
到 满 意 的扩 增 效 果 ， Ｔ Ｒ， 而 Ｃ＇ ／ Ｂ管 则 需 在 ５ ． ０ 医学 创新
２１ ０ １年 １ 月 第 ８鲞筮
Ｍｄ ｅｉ
！ ｎｏ 塑 ｏ ｆ 』
：
：
：
表 １ ＴＲ Ｃ 多 重 引 物 Ｐ Ｒ扩 增 中不 同变 量 Ｃ
技术上的优化 ， 助于确定哪些参数以及如何 应改变这些参 有
数 以尽 量减 少假 阴性 和假 阳性 结 果 。 参 考 文 献
［ ］Ｖ ｎＤ ｎｅ Ｊ ａ ｇｒｋＡ ，Ｂｉｇｍ ｎ ｅ ａ．Ｄ ｓ ｎ ａｄ １ ａ ｏ ｇｎＪ，Ｌ ｎｅａ Ｗ ｒｇｅ ａ ｎＭ，ｔ １ ｅｉ ｎ ｉ ｇ
中性 福 尔 马 林 固定 、 规 石 蜡 包 埋 。 常
１２ 方 法 ．
缓 冲液进行电泳 ， 然后 用 凝 胶 成 像 系 统 检 测 。 目标 位 置 处 见
一
１２ １ 随机选取 ６例 Ｔ—Ｎ Ｌ， ． ． Ｈ 常规 蛋 白酶 Ｋ一酚氯仿法 抽
提 ＤＮＡ。
条或 两条 狭窄而致密的亮带判 断为单克 隆重 排 ， 见条带 未
实 验 性 的 调 整 Ｐ Ｒ参 数 对 Ｆ Ｐ Ｃ Ｆ Ｅ组 织 的 克 隆分 析 ， 能会 有 很 大 的价 值 。 可
【 关键词 】 Ｔ～ Ｈ ； Ｔ Ｒ Ｎ Ｌ ｃ 基因重排 ； Ｐ Ｒ Ｃ
Ｔｈ ｐｔ ｉａ ｉ ｎ ｆＰＣＲ ａ ａ ｅ ｅ ｆ ＴＣ ＲＴ ｕｌ ｐｌ ｒｍ ｅ ｅ ｅ ｒ ａｒ ａ ｅ ｅ ｔ ｉ — Ｎ Ｈ Ｌ Ｄ Ｕ ｈ ｎ — ｒｅ ， ｅ ｏ ｉ ｚ ｔｏ ｓ ｏ ｍ ｐ ｒ ｍ ｔｒｏ ｍ ｔ ｅ ｐ ｉ ｒ ｇ ｎ ｅ ｒ ｎｇ ｍ ｎ ｎ Ｔ ｉ Ｓ ａ ｎｉ
ＴＲ ｃ 多 重 引 物 基 因 重排 ， 建 立 Ｐ Ｒ扩 增 中不 同 变 量 性 能 改 变 的重 要 意 义 。 方 法 以 Ｃ 的 Ｐ Ｒ 方法 检 测 ５ Ｃ ３例 Ｔ—Ｎ Ｌ的 Ｔ Ｒ Ｈ ｃ １基 因 重 排 率 。结 果 Ｔ Ｒ ， 因 重 排 检 测 率 为 ６ ． ％ 。结 论 Ｃ ３基 ２３
争引物 而 可 能 会 抑 制 特 异 性 的 Ｐ Ｒ 扩 增。采 用 优 化 的 Ｃ
Ｔ Ｒ Ｐ Ｒ方 法 检 测 了 ５ Ｃ ￣Ｃ ３例 Ｔ—Ｎ Ｌ 检 测 率 为 ６ ． ％ 。 这 Ｈ ， ２３
一
高 的 检 测 率 与 其 它 文献 相 比证 明 了优 化 方 法 的适 用 性 ｐ 。
Ｐ Ｒ反 应 。Ｐ Ｒ 产 物 长 度 在 ８ ２ ０ｂ 。 （ ） Ｃ Ｃ Ｃ ０～ ２ ｐ ２ Ｐ Ｒ体 系 与 循 环 参数 ： 按 照标 准 的 Ｐ Ｒ反 应 体 系 与循 环 参 数 设 置 不 同 的 ① Ｃ 变 量 （ 表 １ 。② 退 火 温 度 范 围 确 定 ： 取 反 应 体 系 各 成 分 见 ） 选
中国医学创新
２１ ０ １年 １月 第 ８卷 第 ２期
Ｍｅｉａ Ｉｎ ｖｔｎｏ ｈｎ ， ｎ ａｙ２ １ ， ｏ． ｏ２ ｄｃｌ ｎ ｏａ ｏ ｆ ｉａＪ ｕ ｒ．０ １Ｖ １８Ｎ ． ｉ Ｃ ａ
．１ １． ２
・
影 像 与 检 验
・
Ｔ—Ｎ ＬＴ Ｒｙ 重 引 物 基 因 重 排 Ｐ Ｒ Ｈ Ｃ －多 Ｃ 参 数 优 化
ｆ ｒ ａ ｃ ｆＰ ｏ ｍ ｎ ｅ ｏ ＣＲ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ｎ Ｍ ｅ ｈｏ ｓ Ｔ ｈ ｎ ｅ Ｐ ｙ ｌ ａ ａ ｔｒ ， ｅｅ ｔ ｈ ａｅ ｏ ｈ ｌｎ ｎ ａ ｌ ａｉ ． ｉ ｆ ｏ ｔ ｄ ｏ ｃ ａ ｇ ＣＲ ｃ ｃｅ ｐ ｒ ｍｅ ｅ ｓ ｄ ｔ ｃｅ ｔ ｅ ｒ ｔ ｆｔ ｅ ｃ ｏ ｉ ｇ ＴＣＲ＾ ｇ ｎ ｅ ｒ ｖ ｅ ｅｒａ－
通讯作者 ： 杜善 梅
２ １ Ｔ Ｒ Ａ， 管 需 ４ ． Ｃ Ｔ Ｂ ０个 循 环 ， 物 量 ５ ｍ ｌ 上 ， “ 引 ０ｐ ｏ 以 Ｍｇ
终 浓 度 １２ ．５～１７ Ｍ，Ｎ Ｐ终 浓 度 １０～２０ Ｉ ， 到 最 ． ５ｍ ｄ Ｔ ０ ０ Ｍ 达 ｘ
佳扩增效果 ； 退货温度在 ５ ． ０ ９℃ ～ ５５℃ Ｔ Ｒ Ａ管都可达 ６． ＣＴ
１２３ （ ） ％ 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 ： Ｃ ．． １２ Ｐ Ｒ产 物 ５ Ｉ Ｌ＋１ Ｌ上 样 ｘ
１１ 一般资料 ．
收 集 １９ ９ ７～２０ ０ ８年 浙 江 大 学 医学 院 附 属 医
院 及 浙 江 省 内其 它 医 院 的 Ｔ—Ｎ Ｌ标 本 ５ Ｈ ３例 。 全 部 标 本 经
１ 资料 与 方 法
１５ｔ （ 浓 度 １５ｍＭ） ｄ Ｔ ｓ Ｌ 终 浓 度 １０ Ｍ） 引 ． Ｌ 终 ｘ ． ， Ｎ Ｐ ５ （ ５ ， 物 各 ０ ２ ｔ 浓 度 ５ Ｍ ） Ｔ ｑ ｌｓ酶 ０ ２ Ｉ （ Ｕ） 模 板 ． ｘ Ｌ（ ０ ｐ ， ａＰｕ ． Ｌ １ ， ｘ Ｄ Ａ ２ｐ ， 积 不 足部 分 双蒸 水 补 足 。 反 应 条 件 ：５℃ 预 变 Ｎ ． 体 Ｌ ９ 性 ７ｍｉ； 环 条 件 ：５ ℃ 变 性 １ｒｉ， 火 温 度 ５ ． ℃ ～ ｌ循 ｌ ９ ｎ退 ａ ０９ ６． ５ ５℃ １ｍｉ， 伸 ７ Ｃ １ｍｉ，８个 循 环 ； 应 结 束 后 在 ｎ延 ２ｃ ｎ３ 反 ７ ２℃ 延 伸 １ ｎ Ｐ Ｒ 反 应 在 可 以 设 定 梯 度 退 火 温 度 的 ０ ｍｉ。 Ｃ Ｅ ｐｎ ｏｆ 度 Ｐ Ｒ仪 上 进 行 ， 有 １ 不 同 的 温 度 。 （ ） ｐ ｅｄｒ梯 Ｃ 共 ２个 ３ 对 照 ： ｒａ 细 胞 做 阳性 对 照 ； 应 性 增 生 淋 巴 结 作 为 阴 性 对 ｊ ｋｔ ｕ 反 照 ； 蒸水取代样本模 板 Ｄ Ａ为空白对照 。 双 Ｎ
或 涂 片样 条 带 判 断 为 多 克 隆 重 排 。 （ ） ％ 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 ２８
凝 胶 电 泳 ： Ｂｏｒｄ 司 出 品 的 垂 直 凝 胶 电 泳 装 置 的 说 明 按 ｉ ａ公 ． 进 行 灌 胶 上 样 、 泳 、 染 。 银 染 后 凝 胶 见 一 条 或 两 条 条 带 电 银 判 断 为 单 克 隆 重 排 ， 见 条 带 或 涂抹 样 条 带 判 为 多 克 隆 。 未
Ｚ ＯＵＲ ｎ ＬＵＫ ｉ ｈ ｎｏｇ Ｗａｊ ｄｃｌ ｎｖｒｔ， ｉ ５ ２ ３ Ｃ ｉａ Ｈ ｅ ，１ ｕ．Ｓ ａｄ ｎ ｎｉ Ｍｅｉ ｉ ｓｙ Ｚｂ ２ ５ １ ， ｈｎ ｅ ａ Ｕ ｅｉ ｏ
【 ｂ ｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｐｉｉ ｕｔ—ｐｒｍｅ ｒｏ Ｃ ａｄａａｙｅ Ｃ － ｅｅｒａｒｎｅ ｅ ｔ ｎｆ ｍ ｌ Ａ ｓ ｃ】 ｒ ｊｃｉ ｏｏｔ ｚ ｍ ｌ ｖ ｍｅ ｉ ａａ ｔ ｆＰ Ｒ，ｎ ｎｌ ｄＴ Ｒ／ｇｎ ｅｒ ｇｍ ｎ ｏ ａｉ ｅ ｚ ａ ｏ ｒ ｎ
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１２ ４ 采 用 优 化 的 Ｔ Ｒｙ引 物 ， 测 ５ ．． Ｃ＇ 检 ３例 Ｔ —Ｎ ＨＬ标 本
ＴＲ ｃ 克 隆性 重 稍 。 Ｆ
２ 结 果
浓 度 的 常 用 值 。总 体 积 ２ Ｌ：０×ｂｆ ｒ２ ５ ｔ Ｍｇ １ ５ １ ｕｆ ． ｘ ｅ Ｌ， Ｃ２
作 者 单 位 ：５２ ３ 山 东 万 杰 医 学 院 （ 善 梅 ） 浙 江 大 学 病 理 学 ２５ １ 杜 ； 与 病 理 生 理 学 学 系 （ 韧 ） 山 东 省 淄博 市 第 一 医 院 （ 奎 ） 周 ； 刘
杜 善梅 周韧 刘 奎
优化 Ｐ Ｒ多个参数分析福尔 马林固定 石蜡包埋 标本 中 Ｔ细胞 非霍奇金淋 巴瘤 （ Ｃ Ｔ—Ｎ Ｌ） Ｈ 的
优 化 Ｐ Ｒ 循 环 参 数 ， 用 优 化 Ｃ 采 ５ ３例 Ｔ—Ｎ Ｌ 中 ， 用 优 化 的 Ｔ Ｒ Ｈ 采 ｃ 多 重 引 物 克 隆 性
【 摘要 】 目的
【 ｅ ｏ ｄ 】 Ｔ Ｎ Ｌ Ｔ Ｒ ｎ ｒ ｒ ｎｅ ｅｔ Ｐ Ｒ Ｋ ｙｗ ｒ ｓ — Ｈ ， Ｃ ｙｇ ｅ ｅ ｒ ｇ ｎ ， Ｃ ｅ ａａ ｍ
以 Ｐ Ｒ为 基 础 的克 隆分 析 虽 不 是 一 项 新 颖 的 方 法 ， 现 Ｃ 但 有 发 表 的文 章 很 少有 改 变 Ｐ Ｒ 参 数 扩 增 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 Ｃ 包 埋 （ Ｆ Ｅ） 本 的 Ｄ Ａ 模 板 的 研 究 分 析 。本 实 验 以 Ｆ Ｐ ＦＰ 样 Ｎ ＦＥ 组织 中 Ｔ Ｒ Ｃ Ｔ基 因 重 排 为 研 究 对 象 ， 用 Ｔ Ｒ 多 重 引 物 ， 选 Ｃ 通 过 优 化 Ｐ Ｒ多 个 参 数 分 析 Ｔ—Ｎ Ｌ中 Ｔ Ｒ／ 因 重 排 ， 建 Ｃ Ｈ Ｃ ￣基 以 立 Ｐ Ｒ扩 增 中不 同变 量 性 能 改 变 的 重 要 意 义 。 Ｃ