双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。
通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。
实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。
选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。
2. 细胞培养。
将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。
注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。
3. 细胞转染。
将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。
注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。
4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。
在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。
5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。
在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。
加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。
6. 数据统计。
按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。
（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。
在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。
（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明一、测定原理：双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理基于双荧光素酶系统。
该系统由两个互补性的荧光素酶组成：荧光素酶1（Fluc）和荧光素酶2（Rluc）。
荧光素酶1通过氧化反应使荧光素发出蓝色荧光，而荧光素酶2通过氧化反应使荧光素发出绿色荧光。
同时，两个荧光素酶都能够自催化反应，从而有效降低假阳性结果的发生。
二、实验步骤：1.取适量细胞或组织，使用含有测试物的培养基或缓冲液进行处理。
2.将细胞或组织溶解，并离心收集上清液。
3.加入测试试剂盒提供的荧光素底物混合液，共孵育一段时间。
4.使用荧光分析仪测量反应混合物中蓝色和绿色荧光的强度。
5.根据荧光信号的强度计算得出相应的基因表达水平。
三、注意事项：1.本试剂盒需要严格按照说明书操作，避免操作失误导致结果错误。
2.在每一步操作前，请先将试剂保持在合适的温度下，以确保试剂的活性。
3.细胞或组织样本的采集、溶解和上清液的收集需要严格按照操作规范进行，避免样本的损失和污染。
4.在孵育过程中，避免剧烈振荡或震动，以免影响荧光素酶反应的进行。
5.在测量荧光强度时，确保荧光分析仪的参数设置正确，并注意避光操作，以免干扰荧光信号的测量。
四、结果解读：根据测量得到的蓝色和绿色荧光强度，可以计算得到相应的基因表达水平。
一般来说，荧光素酶1的荧光强度与被检测基因的表达水平成正比，而荧光素酶2的荧光强度则用作内参对照。
通过计算荧光素酶1与荧光素酶2的比值，可以更准确地反映被检测基因的表达水平。
结果解读时需要注意的是，双荧光素酶报告基因检测试剂盒只能提供相对量化的结果，无法给出绝对的基因表达水平。
因此，在结果解读时需要结合其他实验数据和相关文献进行综合分析。
总结：双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种常用的基因表达水平检测工具，该试剂盒通过双荧光素酶系统实现对基因表达水平的测定。
在使用时需严格按照说明书操作，注意操作规范和注意事项。
结果解读时应综合考虑其他实验数据和相关文献，以得到准确可靠的结论。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
使用说明：
1. 裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细胞裂解液；
对于悬浮细胞：离心去上清后加入报告基因细胞裂解液。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。 注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
对照。
6. 在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升Renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测
定RLU(relative light unit)。 7. 在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据
来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结果无明显影响。 ¾ 样品和测定试剂混合后，必须等待1-2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ也可以测定更长或更短时间，但
是同一批样品最好使用相同的测定时间。 ¾ 特别注意：Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。Renilla荧光素酶检测
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因检测试剂盒双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种用于检测报告基因表达水平的试剂盒。
报告基因是在转染实验中用来评估转染效率和细胞活性的基因，常见的报告基因包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶等。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒通过测定转染细胞中荧光素酶的活性，从而反映报告基因的表达水平，是科研实验室中常用的实验技术之一。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理是利用荧光素酶底物来测定细胞中荧光素酶的活性。
荧光素酶底物在荧光素酶的作用下发生化学反应，产生发光信号，通过测定发光信号的强度来间接反映报告基因的表达水平。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒具有灵敏度高、操作简便、结果稳定可靠等特点，广泛应用于基因表达调控、信号转导、药物筛选等领域。
使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行实验时，首先需要将转染后的细胞加入培养基中，然后加入荧光素酶底物，经过适当的反应时间后，用微量板阅读器或活体成像系统测定发光信号的强度。
根据发光信号的强度可以判断报告基因的表达水平，进而评估转染效果和细胞活性。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的应用范围非常广泛，不仅可以用于体外细胞实验，还可以应用于体内动物实验。
在基因敲除、基因过表达、siRNA干扰等实验中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒都可以发挥重要作用。
此外，双荧光素酶报告基因检测试剂盒还可以用于药物筛选实验，评估药物对细胞活性的影响，为药物研发提供重要参考。
总的来说，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种在分子生物学实验中应用广泛的试剂盒，具有灵敏度高、操作简便、结果稳定可靠等特点，为科研人员提供了重要的实验工具。
在今后的科研工作中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒将继续发挥重要作用，为基因表达调控、信号转导、药物筛选等领域的研究提供有力支持。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因检测试剂盒导言近年来，基因检测技术在生物医学领域的应用越发广泛，为医生们提供了更多的疾病预防和治疗的手段。
其中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一项基于PCR技术，结合双荧光素酶发光原理，经过特殊的检测报告基因分析、得出结果的高新技术产品。
本文将从介绍双荧光素酶报告基因检测试剂盒的技术原理、检测流程等方面进行详细阐述。
技术原理双荧光素酶报告基因检测试剂盒采用了双荧光素酶发光原理，基于PCR技术代替了传统的差凝法、凝胶法、S-NAT等常规检测方法，新一代的检测方法具有精准、快速、高效、灵敏度高等优点。
针对疑难杂症、高危人群的诊断与筛查，有着不可替代的作用。
检测流程首先，收集患者的生物样本，包括血液、唾液等，进行DNA 提取。
然后，应用PCR扩增技术，将关键目标序列扩增，再进行双荧光素酶与基因序列的结合，使得复合物能够显现荧光物质。
最后通过特殊的光谱仪检测荧光物质的强度，得出结果。
优势特点本产品有着以下优势：1. 高灵敏度：检测结果的灵敏度高，能够检测到非常微小的变化，进而提高检测结果的可靠性；2. 高效率：检测时间短，较传统检测方法的效率大大提高，提升患者检测效率；3. 精准度高：基于PCR技术及双荧光素酶原理，减少了人为的操作失误，提高了检测数据的精准度，有助于医生做出更加准确的诊断；4. 检测结果直观：光谱仪显示荧光值，结果直观，比传统检测结果，操作人员容易理解，减少了数据误解。
结语随着科技的发展，双荧光素酶报告基因检测试剂盒作为一种高新技术产品，应用价值得到了广泛认可。
其潜在的临床应用前景，将会在未来的医疗领域中起到越发广泛和重要的作用。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）一、实验目的：分析启动子活性二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter AssaySystem（Promega）试剂盒来检测。
利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。
在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。
三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）试剂盒，PBS，细胞裂解液，96孔，四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪五、实验方法及步骤：1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。
每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。
实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。
所有的结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。
六、注意事项1.做好对照。
2.多做几个复孔，求平均值。
七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液Dual-Glo?Stop-Glo?底物2.报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或“效果”3.原理–制备含有luc/ R luc的DNA–转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)4.载体- 萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK5.试剂制备–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop &Glo? 底物（现用现配）–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C两步加入试剂：加，读，加，读6.检测步骤：实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。
promega双荧光素酶说明书
promega双荧光素酶说明书
Promega双荧光素酶说明书
一、简介
Promega双荧光素酶系统是一种灵敏的报告基因检测工具，用于检测细胞
或组织中荧光素酶的表达水平。
该系统包括荧光素酶基因报告质粒、荧光素酶活性检测试剂和荧光检测仪。
通过将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，可以监测荧光素酶的表达水平，从而了解基因的表达情况。
二、主要特点
1. 高灵敏度：可检测低至 pg荧光素酶的活性。
2. 快速：可在短时间内完成检测。
3. 简便：无需特殊设备，只需一台荧光检测仪即可完成检测。
4. 稳定：荧光素酶基因报告质粒可在细胞内稳定表达，提供可靠的检测结果。
三、使用方法
1. 转染荧光素酶基因报告质粒：将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，按照说明书操作。
2. 培养细胞：在适宜条件下培养细胞，使荧光素酶表达。
3. 收集细胞：离心收集细胞，并洗涤去除培养基中的荧光素酶抑制剂。
4. 检测荧光素酶活性：将细胞悬浮在检测缓冲液中，加入荧光素酶活性检测试剂，充分混匀后进行荧光检测。
5. 数据分析：通过荧光检测仪获取数据，并使用相关软件进行数据分析。
四、注意事项
1. 请在专业人员的指导下操作。
2. 避免直接接触试剂，以免对皮肤和眼睛造成刺激。
3. 试剂应存放在阴凉干燥处，避免阳光直射和高温。
4. 转染荧光素酶基因报告质粒时，应遵循无菌操作原则，避免交叉污染。
双荧光素酶报告基因检测系统-promega
Dual—Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop ＆Glo® Buffer 10mlStop ＆Glo® Substrate，50X 200ulPassive Lysis Buffer （PLB)，5X 30ml1.1X PLB：加1体积的5X Passive Lysis Buffer （PLB)到4体积的dH20中，40C保存(一个月)。
R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase AssayBuffer II 中（—200C保存1个月,-700C保存1年)。
3.1X Stop ＆Glo 试剂：1体积50X Stop ＆Glo® Substrate加入49体积的Stop & Glo® Buffer中（-200C保存15天）。
（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min,瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。
重组质粒分别为p-629/+100,p—401/+100,p—238/+100，p-80/+100,p—25/+100。
pGL3- basic为阴性对照；同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。
具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent）说明书进行。
1。
将质粒DNA(3。
2µg)与phRL-tk （0。
8µg）按1：4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B 液，混匀30s;2。
A+B混匀（B加入A）15s，室温下孵育5—10 min；3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0。
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双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明
产品说明：
报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。
由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。
荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。
萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。
这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。
本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。
采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。
产品内容：
名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃
Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃
Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃
Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃
Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。
低温运输，-20℃或-80℃避光保存。
有效期6个月。
自备试剂：
PBS、双蒸水等。
操作步骤：
一、裂解细胞：
1)新鲜配制裂解液：临用前，取适量5xUniversal Lysis Buffer(ULB)，用双蒸水稀释至1xULB，混匀。
1xULB可在4℃存放数周。
2)细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS，轻轻洗涤细胞。
完全倾去洗涤液。
3)细胞裂解：推荐按照表中的体积，在孔/皿中加入1xULB，混匀。
培养板可在微型振荡器上震荡5~10min；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5ml离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。
裂解细胞悬液可直接用于发光测定，也可离心30秒，取上清做发光测定。
表：不同容器细胞所需1xULB的体积。
96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板35mm平皿60mm平皿
30µl60µl120µl250µl500µl500µl1000µl
二、配制发光反应液：
测定前，在室温待Fassay Buffer I、Fassay Substrate I、Rassay Buffer II和Rassay Substrate II溶化，混匀（注意避光）。
按20/1比例用Fassay Buffer I稀释Fassay Substrate I，按50/1比例用Rassay Buffer II稀释Rassay Substrate II，分别配制所需体积的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II（注意避光）。
三、测定仪器的设置：
按仪器操作说明开启发光测定仪。
手动操作型仪器，将测读时间设为10~20秒。
自动操作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10~20秒，Fassay Reagent I和Rassay Reagent II的注入体积设定为100μl。
四、手动发光测定：
取待测样品20μl加入测量管底部，取Fassay Reagent I100μl加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)；
取Rassay Reagent II100μl加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Ranilla luciferase的发光单位(RLU)。
如用多孔板同时手动测定多个样品，则将各待测样品20μl分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Fassay Reagent I100μl，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)；取Rassay Reagent II100μl立即加入管底部，轻轻敲击板壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Ranilla luciferase 的发光单位(RLU)。
五、自动发光测定：
配制好的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II置于测定仪内并连接好对应管道，Fassay Reagent I接第一注射管道，Rassay Reagent II接第二注射管道。
各待测样品20μl分别加入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。
记录Firefly luciferase和Ranilla luciferase的发光单位(RLU)。
注意事项：
1)Fassay Buffer I和Fassay Substrate I应避免反复冻熔，可分装成合适体积分次使用。
Rassay Substrate II溶液应盖严存放，避免蒸发。
配制好未用完的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II可在-20℃保存1月左右。
2)细胞裂解液一般在当天测定。
如需隔日测定，应将样品于-20℃保存。
长期保存应在-80℃。
测定样品量可为10~30μl。
3)用多孔板同时手动测定多个样品时，要尽量保证每个样品的两种试剂加入时间间隔一致。
4)Rassay Reagent II可用于直接测定样品的Ranilla luciferase。
需要注意的是，Rassay Reagent II直接测量的RLU要比双荧光素酶顺序检测获得的RLU高一些（反应体积等因素的影响）。