突变基因检测试剂盒研发方案

突变基因检测试剂盒研发方案
一、×××试剂盒研发背景
二、×××试剂盒检测方法及原理
三、×××试剂盒成分
四、×××试剂盒使用步骤
五、×××结果检测和分析
六、×××试剂盒成本计算

人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒
中文名称：
英文名称：
包装规格：
储存条件：-20℃可保存6个月，4-8℃保存一周，避免反复冻融。
有效期：
适用仪器：ABI7500 ARMS real-time PCR检测系统
适用样本类型：新鲜组织、石蜡包埋组织、血液等
检测方法局限性：本试剂盒只适用于规定的仪器和检测系统，检测结果仅供临床参考，不得
作为临床诊治的唯一凭据。
注意事项：本试剂盒仅用于体外研究。
一、BRAF突变检测试剂盒研发背景
B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外
显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK
中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。
针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺
癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突
变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者
接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指
南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf
基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样
本，用于肿瘤组织B-raf基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化
用药提供依据。对黑色素瘤患者选用BRAF基因靶向药物威罗菲尼，结直肠癌患者使用
爱必妥（西妥昔单抗）或维克替比（帕尼单抗）等靶向药物的疗效提供预测。
突变名称 氨基酸变化 碱基变化 COSMIC ID
600Glu V600E GTC＞GAG 476

二、BRAF突变检测试剂盒检测方法及灵敏度
本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术PCR扩增技
术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA
互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进
行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测，提高了检测
灵敏度。
为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的
一个保守片段，长度与B-raf目标片段相似，均为100bp左右，内控探针采用标记ROX基
团的Taqman 探针对内控基因扩增产物进行检测。内控引物、探针及内控基因对ARMS体
系的扩增效率无影响。阳性对照品是B-raf基因V600E突变质粒与野生型人类基因组DNA
的混合物，用于PCR扩增的外质控。
灵敏度：可检测到1%的突变

三、BRAF突变检测试剂盒成分
A 管家基因引物及探针、ROX
B 野生型上游引物F
C 突变型上游引物F
D 共用下游引物R及探针、ROX
D 阳性对照样品（突变基因人类DNA或质粒）
E Mix：0.1U/μl Taq酶 50nM DNTP 750nM Mg2+ PCR反应液
四、BRAF突变检测试剂盒使用步骤
1、DNA提取 使用组织、血液等通用检测试剂盒提取样本DNA并检测浓度（建议浓度
5-15ng/μL）。
2、加样 10μL/20μL体系

试剂 体积 体积
（突变引物及探针+管家基因引物及探针）/（野生引物及探针+管家基因引物及探针） 0.8μL 1.6μL

阳性对照品/待测样品/空白样品 ×μL（10ng） ×μL（10ng）
Mix 5μL 10μL
水 补齐10μL 补齐20μL
突变型反应液：突变型上游引物+共用下游引物及探针+管家基因引物及探针+Mix
野生型反应液：野生型上游引物+共用下游引物及探针+管家基因引物及探针+Mix

引物设计1（来自专利）
Taqman 特异性探针 BRAF-V600E-Probe：FAM-ctcgatggagtgggtcccatcagt-BHQ1
野生型上游引物F：taggtgattttggtctagctacact
突变型上游引物F：taggtgattttggtctagctacaca
共用下游引物R：5’-ctagtaactcagcagcatctcag-3’
管家基因 GAPDH 的上游引物F：ggctgtgggcaaggtcatc
管家基因 GAPDH 的下游引物R :ctccgacgcctgcttcaccac
管家基因 GAPDH 的探针序列 ：HEX-ccttccgtgtccccactgccaacgt-BHQ
基因位点名称 引物名称 序列 浓度
BRAF-V600E-野生
型位点
野生型上游引物F taggtgattttggtctagctacact 500nM

公用下游引物R 5’-ctagtaactcagcagcatctcag-3’ 500nM
BRAF-V600E-
Probe
FAM-ctcgatggagtgggtcccatcagt-BHQ1 100 nM

管家基因 GAPDH
的上游引物F
ggctgtgggcaaggtcatc 5PM

管家基因 GAPDH
的下游引物R
ctccgacgcctgcttcaccac 5PM

管家基因 GAPDH
的探针序列
HEX-ccttccgtgtccccactgccaacgt-BHQ 2.5PM

BRAF-V600E-突变
型位点
突变型上游引物F taggtgattttggtctagctacaca 500nM

公用下游引物R 5’-ctagtaactcagcagcatctcag-3’ 500nM
BRAF-V600E-
Probe
FAM-ctcgatggagtgggtcccatcagt-BHQ1 100 nM

管家基因 GAPDH
的上游引物F
ggctgtgggcaaggtcatc 5PM

管家基因 GAPDH
的下游引物R
ctccgacgcctgcttcaccac 5PM

管家基因 GAPDH
的探针序列
HEX-ccttccgtgtccccactgccaacgt-BHQ 2.5PM

引物设计2（primer premier软件设计）
探针序列：5’-GCCCTGAGATGCTGCTGAGTTAC-3’
突变型引物序列（193bp）：
F： 5’-TTGGTCTAGCTACAGA-3’
R：5’-GTGAATACTGGGAACTA-3’
野生型引物序列（193bp）：
F：5’-TTGGTCTAGCTACAGT-3’
R：5’-GTGAATACTGGGAACTA-3’
管家基因（309bp）
GAPDH上游引物F：5’- AATCCCATCACCATCTTCC -3’
GAPDH下游引物R：5’- GAGTCCTTCCACGATACCAA -3’
管家基因 GAPDH 的探针序列：5’- GGAGTCCACTGGCGTCTTCACC -3’
3、布板设计
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A A1 A2 A3 A4 A5 A6
B B1 B2 B3 B4 B5 B6
C C1 C2 C3 C4 C5 C6
D D1 D2 D3 D4 D5 D6
E
F
G
H
A1 A2 A3为三个重复，A1 A2 A3孔为空白样本+野生型反应液
A4 A5 A6为三个重复，A1 A2 A3孔为空白样本+突变型反应液
B1 B2 B3为三个重复，B1 B2 B3孔为阳性样品+野生型反应液
B4 B5 B6为三个重复，B1 B2 B3孔为阳性样品+突变型反应液

C1 C2 C3为三个重复，C1 C2 C3孔为待测样本1+野生型反应液
C4 C5 C6为三个重复，C1 C2 C3孔为待测样本1+突变型反应液
D1 D2 D3为三个重复，D1 D2 D3孔为待测样本2+野生型反应液
D4 D5 D6为三个重复，D1 D2 D3孔为待测样本2+突变型反应液

样本数为n，反应液配置2+n份
4、PCR扩增
5、电泳

五、BRAF突变检测结果检测和分析
样品反应 结果 分析 指导用药
空白样本+野生型反应液 Ct＞32
质控正常，待测样本数据可信 质控正常，指导用
药可信
空白样本+突变型反应液 Ct＞32

阳性样品+野生型反应液 Ct＞32
阳性样品+突变型反应液 Ct＜30
待测样本1+野生型反应液 Ct＜30 待测样本为野生
型，待测基因未检
测到突变

EGFR单抗类药物

治疗有效
待测样本1+突变型反应液 Ct＞32

待测样本1+野生型反应液 Ct＞32 待测样本为突变
型，待测基因发生
突变

EGFR单抗类药物

治疗无效
待测样本1+突变型反应液 Ct＜30

以上结果仅供临床用药参考，不可作为诊断或用药的唯一依据。

六、BRAF突变检测试剂盒成本计算
名称 公司 市面合成价格 成本

引物合成上海1.2元/碱1.1元/人