大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定
脂联素对低氧条件下大鼠肺微动脉内皮细胞NO生成的促进作用及其机制
脂联素对低氧条件下大鼠肺微动脉内皮细胞NO生成的促进作用及其机制徐海军;张存娟;周宁娟;苏慧;孙新【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2017(048)005【摘要】目的重组人球状脂联素(APN)促进低氧条件下大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)NO的生成,探讨其潜在的分子机制研究. 方法原代培养SD大鼠PMVECs,传至第3代经免疫组化法鉴定细胞传至第3代鉴定细胞;PMVECs分4组,常氧组(210 ml/L O2,37 ℃);低氧组(20 ml/L O2);低氧+APN组(20 ml/L O2+ APN 1 μg/ml),低氧+APN+ L-NAME组(20 ml/LO2,+APN lμg/ml+ L-NAME l μg/ml)处理,各组细胞同时处理(加药)后,培养12 h收集上清,硝酸还原法测NO浓度,RT-PCR测定eNOS mRNA的基因表达Western blot检测AMPK/p-AMPK、PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、eNOS/p-eNOS蛋白表达. 结果鉴定细胞为PMVECs.与常氧组比较,低氧组NO浓度、eNOS mRNA表达水平显著下降(P＜0.01);与低氧组比较,低氧+ APN组低氧诱导的NO浓度、eNOS mRNA表达水平显著增加(P＜0.01);L-NAME可阻断NO的产生和eNOS mRNA的表达.各组AMPK、PI3K、Akt、eNOS总蛋白表达量无差异;与常氧组比较,低氧组中AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表达水平下降(P＜0.05);与低氧组比较,低氧+ APN组AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表达水平增加(P＜0.05);与低氧+APN组比较,低氧+ APN+ L-NAME组AMPK、PI3K、Akt磷酸化表达水平没有变化(P＞0.05);L-NAME可阻断eNOS磷酸化的表达(P＜0.01). 结论低氧条件下APN可促进PMVECs生成NO,其可能机制是AMPK/PI3 K/Akt/eNOS/NO信号通路的激活.%Objective To investigate the production of NO in rat pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs) under hypoxia,and to explore the underlying molecular mechanisms.Methods The third passage of primary culture PMVECs from SD rat were identified by immunohistochemical method and divided into four groups.The PMVECs in four groups were cultured respectively under normoxia condition(210 ml/L O2,37 ℃),hypoxia condition(20 ml/L O2),hypoxia condition(20 ml/L O2) + APN (1μg/ml),hypoxia condition(20 ml/L O2) + APN (1 μg/ml) + L-NAME (1μg/ml).Supernatant and cell lysate were collected after culture for 12 h.The concentration of NO in supernatant was determined by nitrate reductive enzymatic method,the expression of eNOS mRNA was detected by RT-PCR,and protein levels of AMPK/p-AMPK,PI3K/p-PI3 K,Akt/p-Akt and eNOS/p-eNOS were detected by Western blot in each group.Results Primary culture PMVECs were successfully identified.NO production and expression of eNOS mRNA in hypoxia group decreased significantly compared with normoxia group(P ＜ 0.01).NO production and eNOS mRNA expression in hypoxia + ANP group were significantly higher than those in hypoxia group(P ＜ 0.01).L-NAME deceased the production of NO and the expression of eNOS mRNA(P ＜ 0.01).There was no significant difference in total protein levels of AMPK,PI3K,Akt and eNOS among the four groups.Phosphorylated AMPK,PI3K,Akt and eNOS decreased significantly in hypoxia group compared with normoxia group (P ＜0.05).Phosphorylated AMPK,PI3 K,Akt and eNOS increased significantly in hypoxia + ANP group compared with hypoxia group (P ＜0.05).Phosphorylated AMPK,PI3K and Akt showed no significant difference between hypoxia + ANP + L-NAME group and hypoxia + ANP group (P ＜0.05).L-NAME deceased the expression of eNOS phosphorylation (P ＜0.01).Conclusion APN can promote the production of NO from PMVECs under hypoxic conditions at the cellular level by the activation ofAMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO signaling pathway.【总页数】5页(P415-419)【作者】徐海军;张存娟;周宁娟;苏慧;孙新【作者单位】第四军医大学西京医院儿科,西安710032;杨凌示范区医院儿科;第四军医大学西京医院儿科,西安710032;第四军医大学西京医院儿科,西安710032;第四军医大学西京医院老年病科;第四军医大学西京医院儿科,西安710032【正文语种】中文【中图分类】R544.1【相关文献】1.埃他卡林对低氧暴露大鼠脑和肺微动脉选择性扩张作用 [J], 黄景慧;韩文志;金鑫;刘卫;汪海2.埃他卡林对间歇性低氧暴露肺微动脉的选择性扩张作用 [J], 黄景慧;韩文志;张雁芳;段瑞峰;邓浩浩;郭玉红;刘卫;汪海3.急性低氧条件下大鼠循环血中内皮细胞及肺小动脉内皮细胞的改变 [J], 王岸柳;温祥云;刘国贞4.二氧化硫对低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉内皮细胞炎性反应的影响 [J], 田悦;美娜丽;刘雪芹;唐朝枢;杜军保5.低氧条件下大鼠血管内皮细胞的形态观察 [J], 苗兰英;林大勇;白剑;杨葳;张伯阳;王良君;杨菁;刘书林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠肺微血管内皮细胞使用说明
大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。
细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。
肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。
本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养
成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【摘要】目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法.方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力.结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力.结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究.%Objective To establish a simple and efficient method for isolation and culture of adult rat cardiac micro-vascular endothelial cells. Methods Wistar rats were anesthetized and thoracotomy was performed. Cardiac micro-vascular endothelial cells were isolated by heart perfusion and enzyme digestion. The morphology and growth curve of the third generation cells were examined by inverted microsc opy. Its molecular markers factor Ⅷ-related antigen and CD31 were detected by immunocytochemistry and immunofluoresence. The angiogenic ability was examined by matrigel. Results The primary cultured cardiac microvascular endothelial cells in vitro were polygonal or fusiform with typical paving stone-like growth characteristics. At the same time,the cells were positive stained by factorⅧ-related antigen and CD31 and showed angiogenic ability. Conclusions Cardiac microvascular endothelial cells cul-tured by this method possess high purity. The method is easy tooperate and can be used for laboratory and clinical research of cardiovascular diseases.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P530-534)【关键词】细胞培养;内皮细胞;成年大鼠;心肌微血管【作者】陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【作者单位】河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;郑州大学基础医学院,河南郑州450001;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】R331心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立
ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｏ ｗ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ｄ ａ ｍａ ｇ ｅ ｍｏ ｄ ｅ ｌ （ Ｉ ） ， ｗｉ ｔ ｈ ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ｆ ｒ ｅ ｅ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ （ Ｎ） ． Ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｍｉ — ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｓ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｈ ｙ ｐ ｏ ｘ ｉ ａ ， Ｍ ＴＴ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｖ ｉ ｔ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ， Ａｎ ｎ ｅ ｘ ｉ ｎ Ｖ —Ｆ Ｉ ＴＣ ａ ｎ ｄ Ｐ Ｉ ｄ ｏ ｕ ｂ ｌ ｅ ｍａ ｒ ｋ ｉ ｎ ｇ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ｒ ａ ｔ ｅ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｒ ａ ｔ ＣＭ ＥＣｓ ｈ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｔ ｙ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ
内皮实验报告
实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。
实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 每2-3天更换一次培养基。
3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。
二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。
三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。
3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。
四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。
五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。
实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。
二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。
三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。
大鼠血管内皮细胞培养研究
大鼠血管内皮细胞培养研究血管内皮细胞是血管中重要的细胞类型，其在维护血管生理特性以及参与血管病理反应中都具有重要的作用。
大鼠作为实验动物，其血管内皮细胞的研究也是非常重要的。
在这篇文章中，我们将重点介绍大鼠血管内皮细胞的培养技术及其在血管生物学研究中的应用。
一、大鼠血管内皮细胞培养技术1.1 资源准备大鼠动脉、静脉组织、FBS、DMEM/F12、胰酶、胰酶抗性味粉、细胞凝集素、槲皮素、PBS、二氧化碳培养箱、显微镜、离心机、相位对比显微镜、细胞均质器等。
1.2 组织消化将新鲜的大鼠动脉或静脉取出，去除外膜及脂肪组织，用PBS缓冲液清洗数次。
接着，用胰酶液消化组织，割碎后转移到消化液中，37℃孵育1-2小时，直到组织消化完全。
1.3 筛选基质消化完全的组织过筛，筛子孔径为80目。
去掉筛子上的淋渣后，产出的细胞可以用显微镜观察并鉴定是否为血管内皮细胞。
1.4 细胞培养将产出细胞悬浮在完全培养基（DMEM/F12，10% FBS，100ug/mL嘌呤鸟嘌呤，100ug/mL青霉素和50ug/mL链霉素）中，在培养室内孵育。
按细胞密度不同，可选用不同的培养方法，比如单细胞悬浮培养、半贴壁培养和全贴壁培养等。
1.5 纯化细胞如果需要纯化大鼠血管内皮细胞，还需要使用血管壁内形成的凝集素贴壁分离技术，配合药物槲皮素进行消除非内皮细胞。
二、大鼠血管内皮细胞在血管生物学研究中的应用2.1 血管内皮损伤与修复在血管损伤修复研究中，常常会使用拉环法、加热法、切割法、放置血栓等手段产生不同程度的血管内皮损伤模型，进而观察、探究血管内皮细胞的响应和修复机制。
例如研究大鼠颈动脉内皮细胞在内膜损伤后的DNA修复机制是一个非常热门的研究课题。
2.2 血管疾病如高血压、动脉硬化、心血管疾病等，都与血管内皮细胞的损伤和功能异常有关。
通过培养大鼠血管内皮细胞，可以模拟这些血管疾病模型，如在培养基中将NO剂加入，从而模拟高血压或将脂质压入细胞内，模拟动脉硬化等，可以帮助我们更好的探究血管疾病的病理生理机制。
血管紧张素转换酶2在大鼠肺微血管内皮细胞上的表达
作者单位 ： 安徽医科大学第 一附属 医院‘ 急诊内科 、 呼 吸内科 ， 合肥
２ ３ ０ ０ ２ ２
作 者简 介 ： 王
楠， 女， ２ ７岁 ， 硕 士研 究 生 ， 主治 医师 ；
自由词
血管紧张素转换酶 ２
Ｒ ３ ４ ５ ． ５ ； Ｒ ３ ２ ９ ． ２
发 因素 。本 研 究 旨 在 明确 大 鼠 Ｐ Ｍ ＶＥ Ｃ是 否 表 达
Ａ Ｃ Ｅ ２ ， 为今 后 研 究 Ａ Ｃ Ｅ ２在 Ｐ ＭＶ Ｅ Ｃ炎 症 损 伤 过 程 中的作用 机制 提供 实验 基础 。
（ Ｓ Ａ Ｒ Ｓ ） 、 急性 肺损 伤 、 肺 动脉高 压 、 肺纤 维化 的发 生 机 制相 关 。它既 可 作 为一 种独 立 因素 起 作 用 ； 又 可 通 过 肾素 一血 管紧 张素 系统 （ Ｒ Ａ Ｓ ） 中的催 化作 用 间
接参与＿ ３ － ５ ］ 。肺微 血 管 内 皮 细 胞 （ Ｐ ＭＶ Ｅ Ｃ） 覆 盖 于
肺 微 血管 内 面 ， 既参与维持正常 的“ 气 一血 交 换 ” ， 又可 合成分 泌 多 种 生 物 活 性 物 质 。Ｐ ＭＶ Ｅ Ｃ损 伤 是
多种肺 部疾 病 的病 理 特 征 ， 在 Ｓ Ａ Ｒ Ｓ 、 急 性 肺 损 伤 的 发病 机制 中 ， Ｐ ＭＶ Ｅ Ｃ的炎 症损 伤更 被认 为 是一 种 触
（ 上 海生 工公 司合 成 ） ， 兔抗 人 Ａ Ｃ Ｅ ２多 克隆 抗体 、 辣
根 过氧 化物 酶标 记 的羊抗 兔 Ｉ Ｇ ｇ （ Ｓ ａ ｎ ｔ ａ ｃ ｒ ｕ ｚ ， 美 国） ，
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大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩(第三军医大学新桥医院, 重庆 630037)摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。
将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。
血细胞立即从肺组织周围游出。
继而是肺微血管内皮细胞。
成纤维细胞及其他细胞72h才游出。
培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。
后者可通过传代除去。
获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。
关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养 肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。
目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。
故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。
虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。
分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。
国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。
本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。
1 材料和方法1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。
新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。
兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。
荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。
荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。
抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。
L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。
胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。
大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。
1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。
颈动脉放血后,将整个大鼠泡于75%酒精中2-3s,以后用组织剪逐层剪开胸腔。
切下心肺放入盛有含青霉素200U/m、链霉素200L g/ml和Hanks液的三角烧瓶内备用。
1.3 大鼠肺微血管内皮细胞培养大鼠肺微血管内皮细胞原代培养:将盛有心肺组织的无菌三角烧瓶置于超净台,抗生素Hanks液冲洗心肺组织的血迹。
眼科剪剪去肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不应大于1.5mm)。
并将肺组织用锋利的手术刀切成1.5×1×1mm3大小的组织块。
贴入无菌的25cm2培养瓶(1%明胶预置过夜,4℃,用前2h移入CO2培养箱,培养液冲洗)中进行培养。
每瓶贴10块,置培养箱固化2h后,加入含20%新生牛血清、肝素90U/m l、L-谷氨酰胺4mm ol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/ml的RPM I-1640培养基3m l,放入培养箱中培养。
60h后将肺组织块取出。
继续培养7-10d,细胞汇合成单层细胞。
肺组织贴瓶后3d换液,以后每两天换液一次,每次均换1/2。
大鼠肺微血管内皮细胞传代培养: 将长成单层的原代细胞用0.08%胰蛋白酶进行消化,每瓶加入1ml,置常温5m in左右。
镜下观察,当细胞间连接疏松时立即倒出消化液,加入培养基3ml,用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀,吸出0.1m l计数,得出细胞总数后,将含细胞的培养液稀释成(2.5-3.0)×105个细胞/ml的接种浓度。
每25cm2培养瓶接种3ml细胞悬液,与肺微血管内皮细胞相混的血细胞就通过传代除去了。
1.4 肺微血管内皮细胞的鉴定制片: 如同细胞传代将细胞消化成细胞悬液。
再以800rpm离心5min除去含血清的培养液。
向沉降的细胞中加少许Hanks液,用吸管轻轻吹打漂洗后,取少许细胞悬液薄涂于玻片上。
用吸水纸吸干后甲醇固定5-10min取出备用。
189中国应用生理学杂志1997;13(2)X1996-9-20收稿 1997-2-6修回八因子相关抗原间接免疫荧光染色: 用PBS 液冲洗3×3m in。
样品片加1:50兔抗人八因子相关抗血清50L l37℃下密封孵育30min,然后PBS液冲洗3×3min,吸水纸吸干,缓冲甘油封片。
加1:25荧光标记的羊抗兔1g G50L l,并孵育、PBS液冲洗、水吸干及封片后荧光显微镜观察。
对照片第一抗体用PBS液代替,其它步骤同样品片。
异植物血凝素结合试验: 用PBS液冲洗,水汲干后加入25L g/ml荧光标记的异植物血凝素, 50L l在室温密封孵育30min,PBS液冲洗3×3m in,水吸干和封片后荧光显微镜检查。
样品片为肺微血管内皮细胞,对照片为肺动脉内皮细胞。
两者染色过程一样。
2 结果2.1 生长情况 肺组织块贴于培养瓶壁后,血细胞立即从肺组织块边缘向四周游出。
24h肺微血管内皮细胞游出。
60h将肺组织贴块取出后培养瓶中只有肺微血管内皮细胞和血细胞。
7-10d后这两种细胞一起形成细胞单层。
此时进行传代,血细胞被除去,培养瓶中只有肺微血管内皮细胞。
2.2 细胞形态 细胞呈鹅卵石镶嵌状排列,状如梭形或多角形,大小均匀。
胞核清晰,呈卵圆形。
胞浆丰富。
2.3 鉴定情况 八因子相关抗原间接免疫荧光染色样品片阳性,呈明亮的黄绿色荧光,对照片阴性。
异植物血凝素结合试验示肺微血管内皮细胞呈明亮的黄绿色荧光,而肺动脉内皮细胞阴性。
3 讨论M agee[2]曾报道的肺微血管内皮细胞的培养方法采用了含肝素等的选择培养基,使内皮细胞纯度较高。
但分离肺微血管内皮细胞使用昂贵的胶原酶,同时组织剪碎,过滤等程序较为复杂。
而Chen[4]提出一种简单的贴块分离培养肺微血管内皮细胞方法,但由于未使用抗生素,细菌污染的可能性大,培养成功率较低;另外培养中未加用对细胞生长起选择作用的试剂,使内皮细胞混有较多其他细胞。
本文吸取两者优点:进行简单的贴块法分离肺微血管内皮细胞,从而避免使用胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶;采用肝素进行选择性培养,使细胞纯度较高;使用抗菌素,减少细菌的污染,提高成功率。
此方法具有简单经济、重复性好、分离培养出的内皮细胞纯度较高的特点。
鉴定采用最常用的八因子相关抗原间接免疫荧光染色和对肺微血管内皮细胞最具特异性的异植物血凝素结合试验[2],两者均阳性。
证实分离培养的确为肺微血管内皮细胞。
4 参考文献1.宋 为,蔡英年,邓希贤,等.慢性缺氧时肺腺泡内动脉肌化与内皮结构变化的关系. 中国应用生理学杂志 1993;9(4):292-2962.M agee J C,et al.Isolatio n,cultur e and char act erizationo f r at lung micr ov ascular endo thelial cell. A m J p h y siol 1994;267:L433-L4413.谢 崧,钱桂生,杨晓静.大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养和鉴定 第三军医大学学报 1997;已修回4.Chen S F,et al.A new simple metho d fo r isolation ofmicr ov ascular endothelial cells av oiding both chemical and mechanical injuries. M icr ovascular Resear ch 1995;50:119-128CULTURE AND CHARACTERIZATION OF RAT LUNGMICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLSXie Song,Yang Xiaojing,Qian Guisheng,Wang Guansong(Xin qiao Hos pital,T hird M ilitary M edical University,C hongqing 630037)ABSTRAC T Cultures of r at lung m icrovascular endothelial cells(RLM ECs)w ere obtained from perepheral lung tissue.The lung tissue w as cut into sm all pieces and cultured with RPMI-1640containing20%bo vine calf serum,90L g/m l heparin,4mmo l/L L-g lutam ine,100L/m l penicillin and100L g/ml streptomy cin.Erythro-cy tes and leuko cytes left the tissue first,follow ed by RLM ECs.Fibroblasts and other cells g rew after72 hour s of culture.After60hour s of cultur e,the lung tissue w as discarded.RLMECs in flask show ed regu-lar co bblestone m orpholog y and po sitive for binding of the lectin Bandeiraea simplicifo liaⅠand indirect immunofluor esence staining with factorⅧantiserum. KEY WORDS rat; pulmo nar y circulat ion; micro cir culatio n; endo thelial cell; cell cultur e 190Ch in J Ap pl Ph ysiol1997;13(2)。