分子探针简介ppt课件

蛋白质及酶的荧光探针


蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸 引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。 另外蛋白质含有氨基（—NH2 或—NH—），—SH，— COOH和=CO,可用与以上基团发生反应的荧光 衍生试剂对蛋白质标记，进而用色谱及电泳分离紫外可 见或荧光检测蛋白质 蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙 氨酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测 比紫外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射 较强荧光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光 特性会发生变化，从而可以研究蛋白质的结构和测定蛋 白质。这其中有一种叫做免疫荧光技术
免疫荧光技术，即荧光抗体方法，就是把特异性抗原多
次注入动物体，使之产生抗体，将抗体球蛋白从血清中分离 出来，用荧光染料标记，制成荧光标记抗体溶液。免疫荧光 染色比其他的生物染色方法有较高的特异性和灵敏度。抗体 （免疫球蛋白）与荧光染料结合后，仍不失抗体的免疫活性， 称为荧光抗体。用于标记抗体的荧光染料于一般的荧光染料 不同，必须容易与抗体球蛋白结合，又不影响其免疫活性； 还要求性能稳定、容易溶解和标记方法简单。由于蛋白质本 身也具有荧光，为了减少蛋白质本身的荧光干扰，标记抗体 的荧光染料不但荧光量子产率高，还要求荧光发射波长较长。 常用的标记抗体的荧光染料有荧光素异硫氰酸酯、四甲基罗 丹明异硫氰酸酯和罗丹明B200等。
溶剂
1
518
5.2
518/605
甲醇
2
H2O， DMF
535
5.8
536/617
甲醇
3
DMSO
518
3.9
518/600
甲醇 水或 甲醇
4
DMF
500
53
500/526
5
DMSO
528
7.0
528/617
甲醇
6
H2O; DMF
甲醇Leabharlann 42111431/498
探针 序号
溶解 性 H2O, DMF
λmax/n m 352
核酸分子探针种类：目前作为核酸分子探针的有机
分子染料有几十种，按探针分子结构可分为： 菲啶和口丫啶类染料、吲哚和咪唑类染料、 碳菁阳离子染料、苯并呋喃酮（香豆素）类等。
表二：菲啶和口丫啶类嵌入剂及其
与DNA结合物的有关性能

表三：含吲哚和苯并咪唑类嵌入剂及其 与DNA结合物的有关性能 表四：TOTO-1系列染料及其 与DNA结合物的有关性能
离子探针
离子探针？ 什么东东啊？
离子探针的生物及化学依据
大多数的酶要靠金属离子表现其活性
探针离子具有与原生物分子中的金属离子
相同或相似的物理化学行为：如半径、化
学配位性质、立体化学行为等，可以置换
原来这 么简单啊！
蛋白质三级结构
血红素
肽链扭转
血红蛋白的三级结构
表一： 一些生物大分子中有关金属离子参数
0.072 0.140 0.088 4.88 0.67 4.40
0.095 0.0923
Mn+2取代苹果酸酶中的Mg+2后，该酶同样具有催化L苹果酸脱羧地反应活性 碳酸酐酶、羧酞酶及乳酸脱氢酶中含有Zn+2，用Co+3 代替Zn+2，这些酶仍具有活性 伴刀豆球蛋白A含有Mn和Ca，用稀土离子 Eu+3,Tb+3,Gd+3置换Ca+2后，该蛋白仍然保持有结 合糖的活性
分子探针简介
写在前面
经典化学分析：沉淀剂、滴定剂、萃取
剂、指示剂和显色剂等 发展方向：微型化、仿生化、自动化、信 息化 目前最高水平：DNA序列分析中标记碱基 的四种分子荧光探针
微型化：纳米芯片、生物芯片及芯片上的实验室
仿生化：电子鼻和电子舌的传感器 自动化：原位及体内实时在线检测 信息化: 临床、环境及生产过程检测的网络化
探针序 溶解性 号 H2O DMSO
λmax/n m
ε*103/（1mol1*cm-1）
(λex/λem)/n m
性能及应用 不渗透膜；双股DNA 嵌入剂；死细胞染色； 染色体计数染色；电 泳；流动细胞光度法； 氩-离子激光 不渗透膜；死细胞染 色；染色体和细胞计 数染色 渗透膜；染色核酸和 真核生物及一些细菌 的细胞质 渗透膜；RNA/DNA的 辨别测定；溶酶体标 记；流动细胞光度法 不渗透膜；高亲合 DNA标记；死细胞 染 色；电泳prestain；氩离子和He-Ne激光 不渗透膜；A~T选择； 高亲合DNA标记
DNA序列分析中的荧光染料：在电泳分离荧光法检测DNA
序列分析中，通常分四组（A,C,G,T体系）进行，如果用 四种不同的荧光染料为探针,标记一个共同的引物，分别 用在 A、C、G、T四个反应体系中，等于用不同的探针 专一地标记了不同的碱基，利用各荧光探针光谱的差别 便可把不同的碱基区分开,因此选择一组四种合适的染料 成为关键， 它们应满足以下条件： (1)吸收和发射光谱应在可见光区，以降低散射和荧光背景； (2)各染料的荧光发射波长因该有明显不同，以便区分不同染料; (3)应有很强的荧光强度，以获得高灵敏度； (4)不严重干扰引物的杂交作用，使其不影响测序反应效率； (5)染料的存在不严重改变电泳谱图。
非过渡金属离子（饱和电子层结构）
K+1 离子半径 /nm 静电势/ （Z2/r） Zn+2 Mg+2 Ca+2
过渡族金属离子（不饱和电子层结构）
Co+2 Tl+1 Mn+2 Gd+3 0.0938 Eu+3 Tb+3
0.133 0.069 0.055 0.099 0.75 4.80 5.12 3.78
核酸分子荧光探针及核酸染色
沿核酸的螺旋方向看，双螺旋表面有两个沟槽， 一个宽槽和一个窄槽，这两个沟槽使碱基外露， 为分子探针或其他分子与碱基作用提供了空间。
窄槽 宽槽
核酸染色剂及荧光探针的应用
溶液中核酸的定量测定 单分子核酸检测 核酸的凝胶染色体电泳分离检测 在荧光共振能量转移（FRET）技术中的应用 DNA序列分析
生物分子探针
蛋白质及酶的荧光探针
主要类型：
离子探针 核酸分子荧光探针
将生物大分子中的非过渡族金属离子用具有光、磁信息的过渡 族金属离子置换，用这些金属离子与生物大分子的相互作用行 为探查非过渡金属的生物功能，即为离子探针技术。这样就能 对溶剂状态中生物分子构象和行为进行研究，弥补了X射线衍射 方法只能对晶体进行测定的不足。所用的过渡族金属离子就叫