组织工程纳米心包片的基础实验研究

２０１７年１　１月第３６卷第１　１期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ＆ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１７，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１　１　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－５０６２．２０１７．１　１．０１６　

组织工程纳米心包片的基础实验研究　张燕　李晓洋　辛毅　李温斌　秦彦文　

９４５　・基础研究・　

［摘要］　目的：运用组织工程学方法和纳米技术对牛心包进行处理，研究其免疫原性，以期制备免　低疫原性的组织工程补片。方法：采用明胶再基质化、碳化二亚胺／Ｎ一羟基琥珀酰亚胺（简称ＥＤＣ／　ＮＨＳ）交联和高速搅拌复乳溶剂挥发法对牛心包进行相关处理，之后植入大鼠皮下进行观察，通过ＨＥ　染色对比纳米组、交联组、脱细胞组和新鲜组四组植入前后的组织形态学改变，并对各组心包片进行机　械性能、厚度、含水量和钙含量检测；免疫组织化学法检测心包片表面ＣＤ４的沉积。结果：肉眼观察到　大鼠皮下降解率纳米组明显低于脱细胞组，与交联组相当，脱细胞组降解较快；抗张强度测定结果显示，　纳米组抗张强度与交联组（Ｐ＝０．７６）及脱细胞组（Ｐ＝Ｏ．６１）相比较差异无统计学意义，但远低于新鲜组　（Ｐ＜０．０１）；钙含量纳米组远低于新鲜组（Ｐ＜０．００１），与交联组相当；免疫组化结果显示各组心包片表　面均有明显的ＣＤ４沉积，纳米组的排斥反应远低于新鲜组，与交联组相当。结论：组织工程学方法和纳　米技术结合制备的纳米心包片具有低免疫原性，低降解率和抗钙化的优良特性。与交联组相比，纳米微　球的嵌合并未明显影响心包片的机械性能和免疫原性，有望成为构建组织工程补片缓释模型的理想　载体。　［关键词］纳米牛心包；组织工程；免疫原性；钙含量　［中图分类号］　１１５４［文献标志码］　Ａ［文章编号］　１００７－５０６２（２０１７）Ｉ１－９４５－０６　

Ｂａｓｉｃ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｎａｎｏ－ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ＺＨＡＮＧ　Ｙａｈ，ＬＩ　Ｘｉａｏｙａｎｇ，ＬＩ　Ｗｅｎｂｉｎ，　ＱＩＮ　Ｙａｎｗｅｎ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣａｒｄｉａｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ．ＢｅＯ＇ｉｎｇＡｎｚｈｅｎ　Ｈｏ￣ｉｔａｌ　Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｆｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉ—　ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｒｔ，　，　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｖｅｓｓｅｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２９，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｆｉｖｅ：Ｗｅ　ｔｒｅａｔ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ，ａｎｄ　ａｌｓｏ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｌｏｗ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉ—　ｎｅｅｒｉｎｇ　ｐａｔｃｈｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅ—ｇｅｌａｔｉｎ　ｍａｔｒｉｘ　ｏｆ　ＥＤＣ／ＮＨＳ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ—　ｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　ｓｔｉｒｒｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｉｍｐｌａｎｔｅｄ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎ—　ｇｅｓ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ｍｏｓｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｍｏｎｇ　ｎａｎｏ－ｇｒｏｕｐ，ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｒｏｕｐ，ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｆｒｅｓｈ　ｇｒｏｕｐ；Ｔｈｅ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｎａＨｏ—ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｌｏｗ—　ｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ　ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ　ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｅｎｓｉｌｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｒｅ—　ｓｕｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｎａｎｏ－ｇｒｏｕｐ　ｉｓ　ｆａｒ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｆｒｅｓｈ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．Ｏ１），ｂｕｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅ—　ｔｗｅｅｎ　ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．７６）ａｎｄ　ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．６１）；ｔｈｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｎａｎｏ—ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｍｕｃｈ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｆｒｅｓｈ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．００１），ｂｕｔ　ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｒｏｕｐ；Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ—　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ＣＤ４　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａｎｏ・ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｆｒｅｓｈ　ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ　ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｎａｎｏ－ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｐａｔｃｈｅｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｈａｖｅ　ｌｏｗ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｌｏｗ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ．Ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｈａｖｅ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｅｄ　

作者单位：１０００２９首都医科大学附属北京安贞医院一北京市心肺血管疾病研究所心外科（张燕李晓洋李温斌），分子　生物研究室（辛毅）；上气道功能障碍相关心血管疾病研究室（秦彦文）　通信作者：秦彦文，研究员，教授，博士生导师，研究方向：心血管病理生理和转化医学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｙａｎｗｅｎ＠ｖｉｐ．　１２６．ｃｏｒｎ　２０１７年１１月第３６卷第１１期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ＆　ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆｏｒ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｐａｔｃｈｅｓ　［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｎａｎｏ—ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ；Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ；Ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｔｅｎｔ　

组织工程补片广泛应用于心血管外科，而构建　补片的重要基础是支架材料。天然的牛心包因具有　优良的柔韧性、来源广泛、良好的生物学和力学性能　等优良特性而成为组织工程学首选生物材料之　

～¨　。牛心包用于制备组织工程补片需进行脱细　胞处理，以降低其免疫原性，而脱细胞要求完全去除　组织中的细胞，同时不能破坏细胞外基质结构，保留　其机械　和生物学活性ｌ３　Ｊ。前期研究证明采用酶一　去垢剂法脱细胞，可获得具有低免疫原性、机械性能　良好的心包片　。　纳米技术在生物医学方面有广泛应用，如药物、　各类生长因子等体内传递载体　。纳米级聚合物　巨大的比表面积和表面能等效应使之成为许多活性　物质缓释载体的优良选择　ｊ。其中纳米微球是研　究较多的载体，其粒径一般在５０—１　０００ｎｍ＿９ｊ。制　备纳米微球的材料以可生物降解的高分子聚合物为　主，本研究采用已被ＦＤＡ批准的具有良好生物相容　性的聚乳酸．羟基乙酸共聚物（ＰＬＧＡ）为材料　“　。　最终采用冷冻干燥法将二者结合制备纳米心包片，　探讨其生物学特性和免疫原性，为新一代组织工程　补片建立实验基础。　材料与方法　１．试验材料：心包材料来自成年公牛，质量约　５６０ｋｇ，由北京隆吴肉类食品有限公司提供。选取无　损伤、厚度均匀部分迅速清除脂肪、皿凝块等，ＰＢＳ　清洗３遍后，置于ｌ％青霉素一链霉素合剂＋２１ｘｇ／　ｍＬ两性霉素Ｂ＋１０％二甲基亚砜的灭菌ＰＢＳ巾，逐　级降温至一８０￣Ｃ冻存备用。ＳＤ大鼠，８０只，体质量　约２００ｇ，由北京安贞医院动物实验中心提供。　２．实验分组：Ａ组为新鲜组；Ｂ组为脱细胞组：　将新鲜牛心包片充分修剪后，置于１％青霉素－链霉　素合剂＋２　ｇ／ｍＬ两性霉素Ｂ的灭菌ＰＢＳ中，恒温　恒速（３７℃，２００ｒ／ｒａｉｎ）振荡２４ｈ；无菌ＰＢＳ反复冲　洗３遍后置于０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００＋０．２５％脱氧胆　酸钠盐＋０．０２％ＥＤＴＡ的去细胞溶液中，恒温恒速　振荡２４ｈ；置于１％青霉素－链霉素合剂＋２１ｘｇ／ｍＬ　两性霉素Ｂ的灭菌ＰＢＳ中，恒温恒速振荡２４ｈ漂　洗，每６ｈ换液１次；最后置于１％青霉素－链霉素合　剂＋２Ｉｘｇ／ｍＬ两性霉素Ｂ的灭菌ＰＢＳ中，逐级降温　至一８０ｏＣ冻存备用；Ｃ组为交联组：去细胞步骤同Ｂ　组，交联步骤如下：将去细胞心包片逐级降温至　一８０￣Ｃ冻存２ｈ后置于冷冻干燥机中脱水处理２４ｈ；　置于灭菌的２％的明胶溶液中，恒温恒速振荡３ｈ；冷　冻干燥８ｈ后置于ＥＤＣ／ＮＨＳ交联剂中，４℃，２０Ｏｒ／　ｍｉｎ震荡２４ｈ；置于磷酸氢二钠溶液中２ｈ终止交联；　

置于１％青霉素．链霉素合剂＋２　ｇ／ｍＬ两性霉素Ｂ　的灭菌ＰＢＳ中，逐级降温至一８０℃冻存备用；Ｄ组　为纳米组：去细胞加交联步骤同ｃ组，纳米微球填　充步骤如下：采用高速搅拌复乳溶剂挥发法制备出　含有ＶＥＧＦ的纳米微球，将交联的牛心包片逐级降　温至一８０￣Ｃ冻存２ｈ，然后置于冷冻干燥机中脱水处　理２４ｈ，最后将其置于水．油．水复乳中浸泡２４ｈ　备用。　３．ＳＤ大鼠皮下包埋及取材：①腹腔注射１％戊　巴比妥钠（０．５ｍｌＭ１００ｇ）进行麻醉，待麻醉完全后在　大鼠脊柱左侧１　ｃｍ处进行备皮。②严格无菌操作，　将四组心包片取出，经充分冲洗后浸泡于９５％氯化　钠液中，将其修剪成约２ｃｍ×２ｃｍ大小，进行皮下包　埋。③术后取材：四组分别于术后４ｄ、１２ｄ、３０ｄ、６０ｄ　四个时间点分批采用空气栓塞法处死大鼠，四组各　随机选择５只。沿大鼠原切口剪开皮肤３ｃｍ，观察　心包片与周边组织粘连情况，取出心包片并分离表　面黏附组织，１０％中性甲醛固定，择期进行病理学　检查。　４．检测指标及方法：（１）组织学观察：肉眼观察　各组心包片体内降解情况及与周同组织粘连情况。　将各组心包片置于ｌ０％中性甲醛中固定，常规石蜡　包埋，切片后进行ＨＥ染色，光镜下观察各组细胞形　态和纤维排列。　（２）厚度及抗张强度测定：将术包埋四组牛心　包片各随机选取ｌ０片，裁剪出大小均匀的待测样　本，中性滤纸充分吸取表面水分后用数显测厚仪测　定其厚度，每个样本测定５次并　录平均值，然后固　定在单柱立式电动数显式推拉力计上。以２０ｃｍ／ｍｉｎ　的速度将其拉断，记录每个样本断裂时最大拉力值，　计算出抗张强度。　（３）水含量测定：未包埋四组心包片各随机选　取１０片，裁剪出大小均匀的待测样本，中性滤纸充　分吸取表面水分后用微量电子称测定其湿重，然后　放在一８０℃冰箱冻存２ｈ，再置于冷冻干燥机中脱水　处理２４ｈ，用微量电子称测定其干重。含水量测定