多蛋白复合物的分离

大量制备（mg）。通常捕获到的复合物组 GST Pull-down 实验是利用带有 GST 标
分是通过质谱最终分析并对其亚基构成加 签的诱饵蛋白从一个生物样品中亲和纯
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技术 讲座
化一个或几个未知蛋白。主要原理就是 可能是由于复合物形成时亲和标签不易
作者简介
丁晓萍， 现为GE Healthcare 生命科 学部蛋白质科 学产品经理， 2000年加入公 司，负责蛋白 质科学领域的电泳和层析产品的技术支 持、产品应用的研发和市场推广工作。
图1 C. elegans信号传导网络
C18B2.5
C34B12.8
ZK637.11
Y11337A8
CJ7H5.0 F2287.5
见图 2）。实验难度随着不同亚基的大
⑥ 分析技术。高核质比（m/z）以及
小和数量上升而提高。
偏离理想轨道的大离子使得质谱技术无
多蛋白复合物研究的难点如下。
能为力。
① 稳定性。有些亚基与亚基之间
本文重点介绍多蛋白复合物分离技术
的相互作用可能较弱，在用标准生化方 用以鉴定复合物组分以及功能研究。本文
法分离复合物时，这种相互作用有可能 所包含不同部分的流程示意图见图 3。应
品粗品中分离抗原的一种成熟技术。该
GST
命名是有着历史渊源的，其由来是基于
以正确比例混合抗原和抗体时能够产生
沉淀的原理。这里所介绍的方法是一种
切取对应紫色和红色蛋白的条带，再用胰蛋白酶酶切、质谱分析、数据库检索进行鉴定
右边流程代表对照实验。在这个实验中，两个蛋白（紫色和红色）通过SDS-PAGE鉴定和诱饵蛋白有相互作 用；另外一个蛋白（绿色）通过对照可见是假阳性结合
本文无法一一介绍，若需了解更详尽的
Pull-down 是 研 究 蛋 白 - 蛋 白 相 互
信息，请参考文献①。
作用网络的重要工具。该手段已成功用
利用原核和真核宿主来共表达蛋白 于大规模鉴定很多物种（如酵母菌、大
技术正逐渐用于制备大量生化研究中所 肠杆菌、C. elegans）中的蛋白 - 蛋白相
需要的多蛋白复合物。在早期，该方法 互作用。涉及酵母双杂交系统的遗传学
Y53C10A6 F36D1.1 Y40E10.1 Y30A1A1.0
CI4F5.1
K12H4.7
PO6C7.8 F11E6.3
F10G7.9 ZC504.4
T28O1.1 C34F0.4
WC2A11.1
Y54GPA.5
F01F1.6 F36A2.10
ZK058.7 Y74C10AR1
E02D9.1 T2RC12.4
存在的条件下，将样品结合到 GST 上。 1.2 串联亲和色谱纯化（TAP）
该对照可以是表达有 GST（非诱饵融合
串联亲和色谱纯化③与早期描述的方
蛋白）的分别转化细胞裂解物，也可以 法不同之处在于，其利用连续两步亲和
是将 GST 加到非转化细胞的裂解物中。 色谱来分离蛋白质复合物。两步亲和色
设计合适的对照实验非常重要。
（原图来自 Li S. et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science,2004, 303: 540-543. 经AAAS允许重新印刷）
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谱目的是提高纯化过程的特异性继而降
通常使用的一种实验模式就是将树 低假阳性出现的概率。本方法所使用条
脂及其结合的蛋白离心下来，因此称为 件都很温和，这样是为了保持复合物的
“Pul百度文库-down”，原理参见图 4。
完整性并且保证产量的最大化。本方法
使用 GST spintrap 可进行 GST pull- 已成功用与许多案例中。
或抗体，树脂上耦联的配体特异性地结合 缺点进行了总结。
复合物中的组分。Pull-down 实验经常用
于小量分离复合物（mg），主要用于鉴定 1.1 亲和Pull-down实验
每一种亚基。该实验也用于分离特定功能
亲和 Pull-down 实验已经很好地用
研究所需材料，但是其他方法看来更适于 于分离以及随后鉴定蛋白质复合物②。
标签 。第三种方法是免疫共沉淀法，就 是使用一种组分（已知的或假设的）的
Pull-down 实验是利用将复合物吸附 抗体。上述三种方法都是利用连有合适
到树脂上来分离蛋白质复合物。通过亲和 配体的树脂来 Pull-down 生物样品粗提
标签（如 GST、组氨酸、麦芽糖结合蛋白等） 取物中的复合物。表 1 对不同方法的优
果 ；竞争内源性复合物
串联亲和色谱纯化（TAP） 普遍适用 ；具有纯化低丰度蛋白质复合物的能力 ； 蛋白标签的存在也许影响实验结
整个过程使用条件温和
果 ；竞争内源性复合物
免疫共沉淀
不需要克隆以及异源性表达 ；如果有现成的抗体， 非普适，需要获得特异性抗体
纯化过程会很快速
广泛，鉴定相互作用的技术也非常庞杂， 以鉴定的。
切割，被洗脱下来。接下来，该复合物
Bait GST
GST
又结合到钙调素 Sepharose 树脂上（借助
于 CBP 标签），然后用 EGTA 洗脱下来。
最后，该复合物组分用 SDS-PAGE 分离
并通过质谱进行分析。
GST-Bait 对照
Bait
GST
1.3 免疫共沉淀 免疫共沉淀是利用抗体来从生物样
带有 GST 标签的诱饵蛋白与其相互作 结合亲和配体所致。这种情况下，推荐
用蛋白结合，所产生的复合物被捕获在 改变标签所在位置（如由 N 端换到 C 端）
连有谷胱甘肽的树脂上。为排除假阳性 或者给复合物中另一组分带上标签。
所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白
③ 参考文献
Puig O, et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods, 2001, 24: 218-229.
T27F7.3 F11A5.10
T25FB8.2
ZK370.5
C10F3.5 H42K12.1
C37C3.2
T27B5.2
C27D11.1
ZkC25.5 Y57G11C0
T27DP4
Y66B4BR4 C46H11.8
YS4E2A.11
Core Non-Core Literature Scaffold Interolog
白质复合物是潜在的、非 避免这些缺陷十分重要。
常重要的药物靶点。
③ 动力学。一些组分可能同某以特
Pol Ⅱ
许 多 蛋 白 - 蛋 白 相 互 定复合物瞬间结合。这些组分在研究中 作用能够导致稳定复合物 容易被忽视。
的 形 成， 这 些 复 合 物 在 分
④ 大小。多蛋白复合物较大，因此
子水平上能够被分离并鉴 用传统生化技术很难操纵。例如，它们不
定。例如，目前已经能够 能穿过标准滤器来除掉杂质并进入色谱介
快速分离并研究稳定的二元复合物如简 质孔道。
单的抗原 - 抗体复合物以及蛋白酶 - 蛋
⑤ 制备。制备由较多不同亚基构成
白酶抑制剂复合物。蛋白复合物能够由 的多蛋白复合物并不容易。对低丰度复
10 个甚至 100 个以上不同亚基构成（参 合物进行生化研究需要大量原材料。
Srb4 Rox3
Med2 Pgd1
Med6
中，已经发现了 5000 多种 来，这种情况就呈现出假阳性。在破坏
相互作用（参见图 1）。并且， 亚细胞元件后，可能会出现假的相互作
蛋 白 - 蛋 白 相 互 作 用 的 重 用。复合物的组分过表达时，假的相互
要性已经令人意识到 ：蛋 作用也可能出现。严谨的对照实验对于
多蛋白复合物的分离
丁晓萍 （通用电气医疗集团生命科学部，北京，100176）
dio:10.3969/j.issn.1674-0319. 2009.05.007
技术 Technology 讲座
单独存在的蛋白质并不能执行功能， 控，在更大程度上是由翻译后修饰以及 而需要通过同其他蛋白质相互作用来实 蛋白质功能（如基因表达、剪切、酶原 现。现已发表了一些物种中蛋白 - 蛋白 活化、转运、信号转导以及结构等）调 相互作用谱图。这些谱图揭示了广泛存 节来实现的。目前发现，大多数生理过 在的多蛋白复合物以及这些复合物之间 程都需要蛋白 - 蛋白相互作用，并且这 的联系。基因组分析结果表明高等物种 些相互作用是所有物种中大多数生理过 的复杂性并不是由更多数量的基因来调 程的基础。很明显，蛋白 - 蛋白相互作
down 实验，如果出现复合物的收率低，
TAP 的基本原理。简单地说，就是
图4 GST Pull-down实验的流程图
一个诱饵蛋白（一个已知或假想的复合 物组分）同时带上蛋白 A 和钙调素结合
Bait
GST
肽（CBP） 两 个 标 签， 在 这 两 个 标 签 之
GST
间含有烟草花叶病毒（TEV）切割位点。
会被破坏。
该说，蛋白 - 蛋白相互作用分析领域十分
图3 蛋白复合物的分析、制备流程
Pull-down 方法
异源表达带有亲和标 签的潜在复合物组分
添加针对蛋白复合 物潜在组分的抗体
分离天然复合物
生化方法分离纯 化天然复合物
分离重组表达的复合物
重组表达复合 物的每个组分
蛋白复合物分离
重建
① 参考文献
Golemis E A, Adams P D, eds. ProteinProtein Interactions: A Molecular Cloning Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor ,2002.
这 种 双 标 签 蛋 白 以 接 近 自 然 水 平 表 达，
Glutathione Sepharose 细胞裂解液
细胞裂解液
Glutathione Sepharose
因 为 过 表 达 会 导 致 非 生 理 性 相 互 作 用。 该复合物首先利用蛋白 A 标签吸附到 IgG Sepharose 树脂上，然后借助于 TEV
鉴定复合物和它们的组分
结构和功能分析
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表1 各种Pull-down实验对于回收蛋白质复合物的优缺点
方法 亲和 Pull-down
优点
缺点
普遍适用 ；具有纯化低丰度蛋白质复合物的能力 蛋白标签的存在也许影响实验结
技术 讲座
图2 蛋白复合物的例子
用 网 络 十 分 复 杂。 例 如，
② 假阳性。如果分离方法不正确，
在 C. elegans 信号传导网络 无关的组分会同复合物一起被共纯化出
Cse2
Med11
Med1
Med4 Med8
Nut1 Gal11 Sin4
Rgr1
Srb7 Nut
Med7
Srb2 Srb6 Srb5
（m /z ） 以 及 偏 离 理 想 轨 道 的 大 离 子 给 质
本 文 包 括 3 个 不 同 的 Pull-down 方
谱仪所带来的限制问题正通过改造现行 法用于小量分离复合物并鉴定复合物中
设备而得到解决。
各组分。其中两种方法是将复合物中的
一种组分（已知的或假设的）带上亲和
1 Pull-down 实验
② 参考文献
Einarson M Orlinick J. Identification of protein-protein interactions with glutathioneS-transferase fusion proteins, in ProteinProtein Interactions: A Molecular Cloning Manual (Golemis, E. A. and Adams, P. D., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor ,2002.
受表达基因的数量增多造成蛋白质的产 方法以及类似技术对于多蛋白复合物分
量下降问题所困扰。目前，上述情况尽 管仍然存在，但是由于采用了高细胞密 度发酵技术，该问题已经被成功地解决 了。
目前，借助于质谱来直接研究大蛋 白复合物的技术正日益涌现。高核质比
离是有益的补充。假阳性是大规模鉴定 蛋白 - 蛋白相互作用的主要问题。因此， 除了相关对照实验外，必须分别进行复 合物分离和 Y2H 实验来保证数据的可 靠性。随后可以在更接近体内的环境中 加以验证。