核酸适体的技术
核酸适配体简介
核酸适配体简介
nucleic acid oligonucleotides aptamers
适配体的类型：
★反义核苷酸链
★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与它们的 靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反 义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特定靶位点 的识别不够好、有一定毒性等问题,所以要对 适配体中的核苷酸进行了各种各样的化学修饰。 修饰位点一般在碱基、磷酸骨架等。★
寡核苷酸序列形 成可与配体特异 性共价结合的二 级结构，配体如 氨基酸、多肽、 甚至金属离子都 可以同随机 相互作用Selex技术简介
Selex技术简介
核酸适配体的应用
随着筛选技术研究的发展,越来越多靶分子获 得高亲和力的、高特异性的适配体,并广泛应 用于多个研究领域,特别是分子识别检测领域。 与成熟的抗体实验相比,目前适配体可以补充 抗体性能的不足, 但是不能完全取代抗体。
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。 与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基）， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构 改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复 性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望 取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用 。
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面 开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物 活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的 分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结 构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳 定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子 探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分 析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别 分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于 生命活体分析。
核酸适体技术研究发展现状
核酸适体技术研究发展现状
核酸适体技术是一种基于核酸分子的高度特异性识别和结合其他分子的技术。
它的研究发展现状可以从多个方面来进行分析。
首先，我们可以从技术原理和方法的角度来看。
核酸适体技术主要包括SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）和方法的改进。
SELEX技术是通过不断筛选和进化，使得核酸适体与特定的靶分子结合，从而获得高度特异性的适体。
近年来，科研人员对SELEX技术进行了许多改进，如分子进化技术的应用、高通量筛选技术的发展等，使得核酸适体的筛选效率和特异性得到了显著提高。
其次，从应用领域来看，核酸适体技术在生物医药领域具有广泛的应用前景。
例如，核酸适体可以作为药物靶向输送系统的一部分，用于治疗癌症、病毒感染等疾病。
此外，核酸适体还可以用于生物传感器、分子识别和分子成像等领域，为生命科学研究提供了重要的工具和方法。
另外，从研究热点和趋势来看，近年来，随着生物技术和纳米技术的发展，人们对核酸适体技术的研究越来越深入。
例如，一些
学者致力于开发新型的核酸适体筛选平台，以提高筛选效率和特异性；还有一些研究者将核酸适体技术与纳米材料相结合，开发出具
有生物传感和药物释放功能的纳米材料复合物，为生物医药领域带
来新的突破。
总的来说，核酸适体技术在研究发展现状方面取得了许多进展，从技术原理和方法、应用领域以及研究热点和趋势等多个角度来看，都表明了这一技术的巨大潜力和广阔前景。
希望未来能有更多的科
研成果和应用突破，推动核酸适体技术的进一步发展和应用。
核酸适体技术
要功能区有相同的结构域(motif)。核酸适
体与配体的相互作用力包括如下几种类
型:“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、
静电作用和形状匹配等。
核酸适体应用进展
• 生物传感器 • 生物传感器在快速检验中发挥着重要作用,它将分 子识别与信号传导器相结合。应用抗体的免疫传 感器已获得很大进步,但固化在传感器表面的抗体 易衰减而失败,利用适体制成的适体传感器具有以 下优点:(1)固化的核酸可反复变性与复性即使在热、 盐浓度、络合剂使用下也可反复变性;(2)适体容易 以一定厚度连结在固相表面;(3)适体发生信号物广 泛,可以用荧光、酶、生物素、亲和素等。
• 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发 出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散 发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序 列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交 体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝 灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光 几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与 溶液中靶标的量成正比。
THANK YOU!
• 适体技术与纳米技术的结合 • 如分子信标，它是在长度为15～30mer寡 核苷酸探针的两端分别加上5～8mer序列 互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区 互补序列的结合使探针分子形成发夹状结 构。探针的5' -端及3' -端分别联用荧光素分 子及猝灭剂分子。自由状态时,发夹结构的 两个末端靠近,使荧光分子与猝灭分子靠近 (约为7～10nm)。
• 选择性分离出核酸适体后,通过PCR或 殖的效果。
适体与配体的相互作用
• 核酸适体上
基错配、碱基三聚体和碱基平台)
• 大多数核酸适体上都可观察到G-A错
配或G-G错配。这些错配在环与正常
核酸适配体
S 钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 Gquadruplex 二级构型并对此结构 有一定的稳定(wěndìng)作用, 因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对 钾离子的检测
Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识 别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一 芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸 aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地 检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋 白质组学研究的发展起到重共四要十六页作用。
共四十六页
亲和介质 分离 (jièzhì)
S 一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、 纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。
S 如J.Colin Cox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌 酶适配体的自动化筛选。具体(jùtǐ)流程为：通过链酶亲和素 与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。 随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定 的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行 测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到 两天的时间就完成了12轮的筛选。
S Macugen是一种选择性血管内皮生产因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 拮抗剂。
共四十六页
核酸适配体的化学本质(běnzhì)与识 别机理
S 核酸适配体的化学(huàxué)本质是核酸，它与配体的结合是基 于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条 件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、 氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
核酸适配体技术研究
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。 与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基）， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构 改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复 性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望 取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用 。
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面 开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物 活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的 分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结 构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳 定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子 探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分 析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别 分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于 生命活体分析。
核酸适体的应用
▲在蛋白质组学的研究中，用aptamer制备成的核酸
配基阵列更是具有抗体芯片和2-D胶不可比拟的优 势，成为备受青睐的一项工具.
核酸适体的应用
▲作为示踪剂，aptamer在疾病诊断与成像方面也有
巨大应用潜力．已有荧光标记的抗人凝血素核酸配 基用于体内诊断的报道．新药研发方面，aptamer 可以鉴定药物靶标，尤其是多道自动工作站的应用 更是加速药物靶标高通量筛选和功能鉴定的进程.
通过这些研究，希望开发出一系列拥有 自主知识产权的分离基质、诊断试剂和 工具，以成功的应用来促进适体在生命 分析应用中的发展。
• 其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程 分别是自发突变 ﹑自然选择和大量增殖.
核酸适配体
SELEX适体选择的过程RNA或DNA的核酸片段，与蛋白质，多肽或小分子结合，使三维结构互补。
蛋白质，多肽或小分子。
“适”来自拉丁词Aptus匹配。
可应用于各种领域包括传感器探针，用于医疗诊断和环境毒性检测，分子成像，病毒治疗如疫苗和抗病毒药物，靶向药物送的发展与开拓新兴心态注定改变范式病人的护理。
这个有前途的适体可在体外用。
这个过程被称为“SELEX（系统的演变通过指数enrechiment 配体）”，在体外进化，库的单链DNA或RNA包含40-60基地随机序列区在~ 20基本常数序列引物地区有利于放大产生。
SELEX过程继续，直到收敛于一个收集池序列为目标的亲和力和通常得到的周期后8-15选择。
由于他们的高亲和力和选择性，适配体已经成功地分离出目标包括范围广泛小分子，肽，蛋白质，甚至整个cells5-8。
在这里，在技术回顾系列，我们将在评价的适体技术更集中毒性。
特别是，在这个问题上，不同的技术为获得适体，包括“技术”要讨论。
传统的适体的选择技术的“技术”采用SELEX最成功的适体代表1 109 1013的分子在1从library9。
通常选择过程的开始与低比例的核酸蛋白质为检查是否所有的分子结合的target10。
选择第一轮需要长时间的培养时间和不严格的条件，而后来的周期通常需要严格的条件，如改变缓冲液条件下，反应体积和时间的潜伏期。
之间的核苷酸结合后的反应图书馆与靶分子，绑定物种分离通过各种分离技术。
然后，该放大的分子被用于下一轮选择过程。
目标结合的分离未结合的适配体在筛选的过程是成功的适体的选择是至关重要的一步。
适体的选择是通过连续重复丰富目标绑定和未绑定的寡核苷酸去除步骤，其次洗脱，放大，和所选择的寡核苷酸净化。
由于蒂尔克和黄金的第一次尝试使用硝酸纤维素过滤方法，其他几个适体被选定，它仍然被认为是一种有效的分离的方法。
硝化纤维素过滤器的结合用于广泛调查的平衡结合和蛋白质oligonucleitides络合物的动力学性质由于硝基优先保留蛋白质和蛋白质的DNA或RNA复杂但不是免费的寡核苷酸。
aptamer introduction核酸适配体的介绍
Ito等人利用三碘甲腺原氨酸作为反向筛选物质，获得能特异识别四碘甲腺原氨 酸的核酸适体。
Methods, 2000, 22: ed它们的删减往往会减弱核酸适体的结合 作用。但在有些筛选中，固定序列也可能与中间的随机序列形成一些二级结构从而 干扰核酸适体的筛选。因此，在得到核酸适体序列后还需要进一步的截短实验来确 定核酸适体的核心序列。
1.1 新型分子探针——核酸适体 (aptamer)
核酸适体：能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸
“Aptamer”: Latin word “aptus” 适合 + Greek word “meros” 粒子
1.1.1 核酸适体的优点
核酸适体与抗体的性能比较
性能
பைடு நூலகம்
核酸适体
抗体
大小
5-15 KD1.2.2 核酸的种类（1）结构限制性（structurally constrained library）：将随机碱基置于能形成特 定二级结构（如发夹、G-四面体或假结等二级结构）的固定序列中。当知道靶标分 子优先结合某种特定的结构蛋白时或增加所选择的核酸适体的稳
（2）反向筛选（counter selection）是为了获得专一性更强的核酸适体而提出 的，主要是通过一些方法去除能结合与靶分子类似物质的核酸序列。这种方法 首先在筛选茶碱核酸适体的实验中使用。
Jenison等人利用与茶碱结构仅差一个甲基的咖啡因作为反向靶标对茶碱进行筛 选，获得了只结合茶碱而与咖啡基因组中某段感兴趣的核酸序列（50-500 碱基）两端引入用于PCR扩增的固定序列。
1.2.3 核酸适体靶分子的多样性
简 Zn2+ 单 Ni2+ 体 系 金属离子
核酸适配体识别原理
核酸适配体识别原理核酸适配体识别原理是基于生物化学原理，通过适配体的选择性亲和性识别目标核酸序列的一种技术。
本文将从以下几个方面介绍核酸适配体的原理和相关知识。
一、核酸适配体的基本定义和作用核酸适配体是一种单链的DNA或RNA分子，它们具有特定的空间结构和亲和性，可以与目标核酸的特定位点结合，实现对目标核酸的无标记检测、定量和成像等。
二、核酸适配体的选择方法核酸适配体的选择可以通过体外进化技术，如选体法、SELEX法等。
选体法是利用化学标记的核酸诱导选择反应，筛选出具有亲和性的核酸适配体。
SELEX法则是通过多轮体外进化演化产生高亲和力的核酸适配体。
这两种方法的主要区别在于，选体法通过将两个核酸结合起来，筛选出与目标核酸结合最紧密的分子，而SELEX法要求在体外化学和物理环境下不断利用多轮筛选获得高亲和力的分子。
三、核酸适配体的结构和特点核酸适配体的结构通常是单链的DNA或RNA分子，具有平面或马鞍形。
它们能够通过空间结构方法识别目标核酸的特定序列，同时还具有高亲和力和选择性。
此外，核酸适配体的合成成本低，易于制备，因此被广泛应用于生物医学、生物技术等领域。
四、核酸适配体的应用核酸适配体的应用非常广泛，主要包括生物分析、诊断、药物传递和治疗等领域。
常见的应用，如荧光标记技术，可以通过搭配不同颜色的标记使实验结果更加直观。
此外，核酸适配体还可用于分析单个分子，对单个分子进行检测，避免了外部信息对分子系统的影响。
五、核酸适配体的发展前景核酸适配体作为一种新兴的生物技术，拥有广阔的应用前景。
目前在生物医学和生物技术领域的应用中，核酸适配体技术已经成为了切实可行的分析方式之一。
未来，随着逐渐成熟的技术和更加精细的研究，核酸适配体技术无疑会为更多领域的发展带来新的可能和机遇。
综上所述，核酸适配体技术的发展让人们看到了一个全新的生物接口，它将以自身独特的方式推动生物学和医学的研究。
未来，我们有理由相信，核酸适配体技术将在更广泛的领域得到应用。
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• 药物设计和临床治疗 • 由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能 抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,体内 渗透力强,因此是一种很有发展前途的药物 分子,可用于直接干扰疾病的发生发展过程。 迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤 相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、 氨基糖类抗生素的适体已在治疗中展示了 良好的应用前景。
SELEX技术
SELEX是指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment)的简称,其筛选流程包 含和达尔文进化理论一样的三个过程,分别是自发突变、自然 选择和大量增殖。
一“自发突变”
• 利用现有的分子生物学技术人工合成一个 含有10
• 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发 出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散 发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序 列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交 体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝 灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光 几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与 溶液中靶标的量成正比。
研究核酸与蛋白质的相互作用的方法 ----核酸适体技术
• 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的 能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡 聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识 别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物 传感器、新药开发以及纳米技术等方面有 着广泛的用途。
这一步起到达尔文进化论中自发突变的作
用。
二“自然选择”
• 单链的随机寡核苷酸序列,容易形成可 与蛋白质、核酸等配体特异性共价结 合的二级结构。在这一高亲和力特异 性结合的基础之上,配体如进化论中的自然选择作用。
三“大量增殖”
• 适体技术与纳米技术的结合 • 如分子信标，它是在长度为15～30mer寡 核苷酸探针的两端分别加上5～8mer序列 互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区 互补序列的结合使探针分子形成发夹状结 构。探针的5' -端及3' -端分别联用荧光素分 子及猝灭剂分子。自由状态时,发夹结构的 两个末端靠近,使荧光分子与猝灭分子靠近 (约为7～10nm)(motif)。核酸适
体与配体的相互作用力包括如下几种类
型:“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、
静电作用和形状匹配等。
核酸适体应用进展
• 生物传感器 • 生物传感器在快速检验中发挥着重要作用,它将分 子识别与信号传导器相结合。应用抗体的免疫传 感器已获得很大进步,但固化在传感器表面的抗体 易衰减而失败,利用适体制成的适体传感器具有以 下优点:(1)固化的核酸可反复变性与复性即使在热、 盐浓度、络合剂使用下也可反复变性;(2)适体容易 以一定厚度连结在固相表面;(3)适体发生信号物广 泛,可以用荧光、酶、生物素、亲和素等。
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配或G-G错配。这些错配在环与正常
的双螺旋碱基对之间的堆积处产生一
个转折点,通常导致环的关闭。
• 核酸适体与配体结合时,通常会通过构
型适配形成一些稳定的二级结构,如发
卡(hairpin)、茎-环(stem-loop )、G四聚体( G-tetramer )、假节 (pseudoknot )。
• 与同一种配体结合的核酸适体往往可分为
• 选择性分离出核酸适体后,通过PCR或 殖的效果。
适体与配体的相互作用
• 核酸适体上富含嘌呤的环常作为外来靶序
列的结合位点,常为嘌呤-嘌呤排列(包括碱
基错配、碱基三聚体和碱基平台)
• 大多数核酸适体上都可观察到G-A错
• 核酸适体出现以后,由于其高特异性与高亲 和性的特性,使得核酸适体立即在纳米技术 领域引起了科学家们的注意,应用适体的分 子信标名为“适体信标”(Aptamer beacon)。适体信标更加稳定灵敏核酸适体， 将在发展各种可以取代抗体的蛋白质探针、 测定体内蛋白质和研究其功能、疾病早期 诊断等方面具有极大的应用潜力。