磷酸钙转染法
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第五天 观察检测实验结果。冻存细胞。
一
细胞培养概述
体外培养
器官培养 organ culture 组织培养 tissue culture 细胞培养 cell culture 取自体内, 模拟体内生 理环境，在无菌、适当温度 和一定营养条件下生存和生 长并维持其结构和功能。
基本概念
细胞系（Cell
细胞生存环境、条件和代谢
环境：
首要条件：培养环境无毒和无菌
基本条件：生存环境无任何污染、代谢物及时清除。
温度：
人哺乳动物为37 ℃ ，鸟类为38.5℃。
Î Â ¶ Ô Ï û É ³ µ Ó ì ÂÈ Î È ¶¶ Ô ¶ ¸ ¸ Ï° °ú û ú ɤ ¤ ³Ä Ä µ° ° Ó Ï Ï ì
培养细胞的运输
冷冻储存运输：液氮或干冰。
细胞悬液空运：冰盒。
充液法
长距离运输(几天)：
培养液至瓶颈部，放在携带者贴身口袋。
短距离运输(几小时)：
培养液覆盖单层细胞，细胞面朝上带回。
细胞库及网址
中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研 究院细胞资源中心 http://www.cellbank.org.cn/index.asp
American Type Culture Collection 网站 http://www.atcc.org
无菌操作技术
（一）实验前的准备
根据实验的要求，将所需物品及试剂灭菌消
毒。
清点所需用品，一并放人超净台内；
（二）无菌室和操作野消毒
实验前，将实验器材放人超净台内，
打开超净台紫外线灭菌灯，照射30分钟， 关闭紫外线灯，同时起动超净台风机
肉眼观察培养基的颜色变化
桃红色：正常情况
橙黄色: 细胞生长状态良好
淡黄色: 培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多
紫红色: 细胞没有生长、生长状态不好、或已死
亡
相差显微镜观察活细胞
细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没 有空泡，胞膜清晰。培养上清清澈透明，看不到悬 浮的细胞或碎片。
连续或无限细胞系（
细胞培养的优点：
1.
可长时间监控、检测，定量评估一部分 活细胞的情况。 研究条件可人为的控制。
2.
3.
4.
研究的样本可以达到比较均一性。
研究的内容便于观察、检测和记录。
5.
6.
研究的范围比较广泛。
研究的费用相对较经济。
细胞培养的缺点：
生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内
环境，但仍有很大差异。
（三）无菌操作基本要求
（四）实验后的要求
关闭超净台风机和电源；
用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳
成束分类归放； 最后用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。
第一天
细胞复苏 第二天 观察细胞状态，决定是否给细胞 换液。 第三天 细胞传代 第四天 用 磷酸钙法将外源基因GFP， TNFR）导入哺乳动物细胞 第五天 观察检测实验结果。 第六天 细胞冻存
细胞类型和生长方式
贴壁细胞和悬浮细胞： 根据是否附于支持物上生长的特性划分。
贴壁细胞传代需要用胰酶处理。
细胞生长与增殖
• 传代 (passage或subculture)
当培养细胞增殖到一定密度后，分离出一部
分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一
过程称之为“ 传代” 。
培养细胞的形态学方面检测
细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗
粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特 点。
细胞的储存
低温保护剂：
甘油和二甲亚砜(DMSO)，常用浓度为5-20％。
补加血清：
在冻存液中，另补加10-20％左右的血清。
冻藏温度：
液氮罐，液氮-196℃，可长期保存。 -80 ℃低温冰箱，可保存一年或更长时间。
生物学综合实验 ------细胞生物学部分
张丽君
基本目的
了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则,
掌握贴壁细胞复苏、传代和冻存的方法；
了解外源 DNA导入哺乳动物细胞的实验原理, 掌
握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。 加深对课堂学习知识的理解和印象，为进一步从 事与本学科有关的科学研究打基础。
• 洗手、着装与外科临床要求相同； • 手指不能触及器材使用端 ； • 一切操作都要在火焰周围进行， • 瓶口要顺风斜放在支架上，试剂使用后立即封闭瓶口； • 细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管 • 瓶口液滴不能再进入瓶内； • 动作要准确敏捷，尽量避免空气流动； • 在实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。
line）：原代培养物经首次传 代成功后即为细胞系。 strain）：通过选择法或克隆 法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊 性质或标志的培养物称细胞株。
细胞株（Cell
有限细胞系（finite
cell line）：细胞系形成 后仅能维持有限传代次数，最后死亡。 continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获得 不死性）和能反复进行传代的细胞系。
ý ³ Ê ö Ö °Ô ¸ û Ï
×Ê Î î  ¶ È
10 20
30
40
50
 ¶ Î È
气体：氧气和二氧化碳
95％空气+5％二氧化碳
O2 ：氧气参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生 长、增殖和合成各种所需成分。
CO2：主要作用在于能维持培养基的pH值。 pH：大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，加缓冲剂来 维持培养液pH的恒定。
细胞复苏
快速融化
将细胞投入到37C水浴，使其快速融化。 细胞外结晶在很短时间内即融化，能避免由
于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞 造成损害。
实验材料及仪器 一．材料： 人胚肾细胞系293 细胞营养液（ DMEM液体培养基 ,10％胎牛血清,双抗 100单位/ml） 消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA· Na） Hank’s液 细胞培养皿 50ml、15ml一次性离心管 10ml玻璃吸管（灭菌） 与玻璃吸管配套的吸球及胶管 二．仪器： 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
实验内容：
实验一 细胞复苏 实验二 细胞的传代培养 实验三 磷酸钙介导的外源基因导入哺乳动物细 胞
实验四 实验结果观察检测 实验五 细胞冻存
时间安排：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一天 细胞复苏。
第二天 观察细胞状态，包括成活情况和生长状况， 决定是否给细胞换液。
第三天 细胞传代。
第四天 用磷酸钙法将外源基因GFP(TNFR)导入哺 乳动物细胞。
一
细胞培养概述
体外培养
器官培养 organ culture 组织培养 tissue culture 细胞培养 cell culture 取自体内, 模拟体内生 理环境，在无菌、适当温度 和一定营养条件下生存和生 长并维持其结构和功能。
基本概念
细胞系（Cell
细胞生存环境、条件和代谢
环境：
首要条件：培养环境无毒和无菌
基本条件：生存环境无任何污染、代谢物及时清除。
温度：
人哺乳动物为37 ℃ ，鸟类为38.5℃。
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培养细胞的运输
冷冻储存运输：液氮或干冰。
细胞悬液空运：冰盒。
充液法
长距离运输(几天)：
培养液至瓶颈部，放在携带者贴身口袋。
短距离运输(几小时)：
培养液覆盖单层细胞，细胞面朝上带回。
细胞库及网址
中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研 究院细胞资源中心 http://www.cellbank.org.cn/index.asp
American Type Culture Collection 网站 http://www.atcc.org
无菌操作技术
（一）实验前的准备
根据实验的要求，将所需物品及试剂灭菌消
毒。
清点所需用品，一并放人超净台内；
（二）无菌室和操作野消毒
实验前，将实验器材放人超净台内，
打开超净台紫外线灭菌灯，照射30分钟， 关闭紫外线灯，同时起动超净台风机
肉眼观察培养基的颜色变化
桃红色：正常情况
橙黄色: 细胞生长状态良好
淡黄色: 培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多
紫红色: 细胞没有生长、生长状态不好、或已死
亡
相差显微镜观察活细胞
细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没 有空泡，胞膜清晰。培养上清清澈透明，看不到悬 浮的细胞或碎片。
连续或无限细胞系（
细胞培养的优点：
1.
可长时间监控、检测，定量评估一部分 活细胞的情况。 研究条件可人为的控制。
2.
3.
4.
研究的样本可以达到比较均一性。
研究的内容便于观察、检测和记录。
5.
6.
研究的范围比较广泛。
研究的费用相对较经济。
细胞培养的缺点：
生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内
环境，但仍有很大差异。
（三）无菌操作基本要求
（四）实验后的要求
关闭超净台风机和电源；
用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳
成束分类归放； 最后用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。
第一天
细胞复苏 第二天 观察细胞状态，决定是否给细胞 换液。 第三天 细胞传代 第四天 用 磷酸钙法将外源基因GFP， TNFR）导入哺乳动物细胞 第五天 观察检测实验结果。 第六天 细胞冻存
细胞类型和生长方式
贴壁细胞和悬浮细胞： 根据是否附于支持物上生长的特性划分。
贴壁细胞传代需要用胰酶处理。
细胞生长与增殖
• 传代 (passage或subculture)
当培养细胞增殖到一定密度后，分离出一部
分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一
过程称之为“ 传代” 。
培养细胞的形态学方面检测
细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗
粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特 点。
细胞的储存
低温保护剂：
甘油和二甲亚砜(DMSO)，常用浓度为5-20％。
补加血清：
在冻存液中，另补加10-20％左右的血清。
冻藏温度：
液氮罐，液氮-196℃，可长期保存。 -80 ℃低温冰箱，可保存一年或更长时间。
生物学综合实验 ------细胞生物学部分
张丽君
基本目的
了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则,
掌握贴壁细胞复苏、传代和冻存的方法；
了解外源 DNA导入哺乳动物细胞的实验原理, 掌
握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。 加深对课堂学习知识的理解和印象，为进一步从 事与本学科有关的科学研究打基础。
• 洗手、着装与外科临床要求相同； • 手指不能触及器材使用端 ； • 一切操作都要在火焰周围进行， • 瓶口要顺风斜放在支架上，试剂使用后立即封闭瓶口； • 细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管 • 瓶口液滴不能再进入瓶内； • 动作要准确敏捷，尽量避免空气流动； • 在实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。
line）：原代培养物经首次传 代成功后即为细胞系。 strain）：通过选择法或克隆 法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊 性质或标志的培养物称细胞株。
细胞株（Cell
有限细胞系（finite
cell line）：细胞系形成 后仅能维持有限传代次数，最后死亡。 continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获得 不死性）和能反复进行传代的细胞系。
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气体：氧气和二氧化碳
95％空气+5％二氧化碳
O2 ：氧气参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生 长、增殖和合成各种所需成分。
CO2：主要作用在于能维持培养基的pH值。 pH：大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，加缓冲剂来 维持培养液pH的恒定。
细胞复苏
快速融化
将细胞投入到37C水浴，使其快速融化。 细胞外结晶在很短时间内即融化，能避免由
于缓慢融化使水分渗入细胞内再结晶对细胞 造成损害。
实验材料及仪器 一．材料： 人胚肾细胞系293 细胞营养液（ DMEM液体培养基 ,10％胎牛血清,双抗 100单位/ml） 消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA· Na） Hank’s液 细胞培养皿 50ml、15ml一次性离心管 10ml玻璃吸管（灭菌） 与玻璃吸管配套的吸球及胶管 二．仪器： 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
实验内容：
实验一 细胞复苏 实验二 细胞的传代培养 实验三 磷酸钙介导的外源基因导入哺乳动物细 胞
实验四 实验结果观察检测 实验五 细胞冻存
时间安排：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一天 细胞复苏。
第二天 观察细胞状态，包括成活情况和生长状况， 决定是否给细胞换液。
第三天 细胞传代。
第四天 用磷酸钙法将外源基因GFP(TNFR)导入哺 乳动物细胞。