真核细胞转染操作方法
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：
(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的
情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列
得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：
克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定
下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
一、试剂准备
1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。
2、核酸贮存液，过滤除菌。
3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。
二、操作步骤
(一)克隆目的基因
1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特异性扩增片段，连入T载体。
3、转化DH5α，质粒制备。
4、酶切初步鉴定，测序证实。
(二) 真核重组表达载体的构建：
pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗
生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。
重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切
回收插入片段和pcDNA3线性片段
T4连接酶连接
转化DH5α
质粒制备
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。
(三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞：
1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿(35mm)，每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。
典型贴壁细胞平板密度生物科研https://www.360docs.net/doc/1418540911.html,
3、 SHG-44细胞的转染：
(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。
(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μl(30μg/ml)。
②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。③混合溶液A
和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。
(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)，边加边轻摇培养板。
(4) 37℃孵育6hr。
(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。
(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。
4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。
(一)筛选结果鉴定：
(1)基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
(2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。
(3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算
克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
参评《细胞核──系统的控制中心》教学设计
《细胞核──系统的控制中心》教学设计 赤峰市宁城高级中学赵海江 一．指导思想与理论依据：“以学生发展为本”的新课程理念正在改变着我们的思想，“改变过去强调接受学习、死记硬背、机械训练的现状，倡导学生主动参与、乐于研究、勤于动手”的观点已成为课堂教学的核心。高中生物必修1《分子与细胞》模块是整个高中阶段生物学的基础。主要是让学生从细胞中的分子水平认识生命的物质基础和结构基础。本节为细胞结构的最后一节，在前面学习细胞膜和各种细胞器结构和功能等内容的基础上，学生对细胞的亚显微结构和功能的认识更加全面完整，也为后续的学习作了铺垫，如细胞核的结构和功能是生物遗传的基础，染色质和染色体的关系是学习细胞有丝分裂时染色体变化的基础，也使学生对“结构和功能相统一”的观念有进一步认识。另外，其中的几个经典实验也让学生体验了生物学研究的一般方法和过程。同时也为继续学习必修2《遗传与进化》及必修三《稳态与环境》打下很好的基础。依据课程标准要求：1、阐明细胞核的结构与功能（Ⅱ）2、尝试建立真核细胞的模型（Ⅰ）进行教学设计。 二．教学背景分析 1、学习内容分析： 本节教材承前面的细胞膜和各种细胞器结构和功能等内容，使学生对细胞的亚显微结构和功能的认识更加全面完整，也为以后的学习作铺垫，如染色质和染色体的关系是学习细胞有丝分裂时染色体变化的基础，细胞核的结构和功能是以后学习遗传的基础，也使学生对“结构和功能相统一”的观念有进一步认识。另外，其中的资料分析也让学生体验了生物学研究的一般方法和过程。 2、学生情况分析：经过初中阶段的学习，学生对细胞的整体结构如细胞膜、细胞质、细胞核有了初步认识，但学生的生物学知识还很薄弱，对于基因是如何通过控制蛋白质的合成、进而控制生物的遗传和代谢，以及细胞分裂的知识还不了解。因此在进行“细胞核结构”的教学时不能进行过多的拓展和延伸。以免造成不必要的认识障碍。另外，他们具有一定的分析问题的能力，实施问题探究教学是可行的，以问题引发兴趣，让新知识与旧知识融为一体，让学生
新型原代细胞转染试剂
简介 人们尝试过很多方法将质粒DNA 导入细胞，常用的有DEAE 右旋糖苷，磷酸钙沉淀，脂质体，显微注射和电击等物理方法。现有的转染技术都或多或少的有各种不足，其中转染效率低，细胞毒性高是研究者最常遇到的困扰；而许多细胞系，特别是原代细胞是很难获得理想的转染效果的。现有的转染试剂产品在应用中还有一个普遍的问题，就是不太可能采用单一一种试剂在各种细胞上都获得较高转染效率；因此研究者不得不尝试很多种类的转染试剂而获得特定细胞的最佳转染效果。如果某种转染试剂盒可以在各种细胞——包括哪些“抗拒转染”的细胞?——的转染实验中都能获得好结果，对于广大研究者来说将是一个福音。 为了达到研究者的这种期望，默克Novagen 经验丰富的研究团队开发了NanoJuice?转染试剂盒，其两种组分互相促进，可以提高各种哺乳动物细胞的转染效果。采用最新的纳米科学技术Priostar? dendrimers （树枝状聚合物） 和多价阳离子脂质体的特别设计，NanoJuice 转染试剂混合物可以确保获得卓越的转染效率而细胞毒性极低。这种新的转染方法会帮助研究者在原代细胞和那些“顽固抵抗转染”的细胞上轻易获得成功。NanoJuice 试剂盒中的两种试剂经过调节配比，很方便为不同的细胞设定最佳转染效果的使用方法。有了NanoJuice 转染试剂盒就再也不需要不断地为每一种细胞从头摸索不同转染方法或尝试各种产品了。我们建议您采用预试验为特定的细胞找到最佳试剂用量，通常这个小试可以在24孔板中进行；一旦最优化的转染试剂用量确定了，后续的操作可以在此基础上非常方便地用等比缩放来轻松获得稳定的高效转染。 确定最佳转染条件预实验 我们在一些原代细胞和其它较难转染的细胞上做了预试验，以便摸索试剂的最佳用量和配比。每个试验设定6种条件，包括每ug DNA 采用2种不同用量的NanoJuice 核心转染试剂和4种不同用量的转染增强试剂（图1）。通常，NanoJuice 的最适使用量范围是：核心转染试剂1-2ul / ug DNA ，转染增强试剂1-4ul / ug DNA 。预试验结果显示，每种细胞的最佳转染效果采用的两种转染试剂成分的比例可能差别甚大（图2）。我们的尝试表明每一种细胞均需设置预试验以获得最优化的实验条件，同时这些数据也证明了NanoJuice?转染试剂盒是一种多功能转染工具，可以作为各种细胞高效转染的首选。不断在各种细胞上尝试NanoJuice 转染试剂盒发现其两种试剂成分的用量可以根据不同细胞的实际情况有更大幅度的调整。例如：Caco-2细胞的预试验中，NanoJuice 核心转染试剂和转染增强试剂都是1ul / ug DNA 。而进一步的尝试发现两种试剂的用量可以更低一些，分别为1ul 和0.75ul ，而转染效率有小幅提高（图3）。 图1 确定最佳转染条件的预实验，尝试8种转染核心试剂与转染增强试剂的不同配比，每种做3个重复。 https://www.360docs.net/doc/1418540911.html, 第 2 页，共 21 页 下一页 返回
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤： 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁细胞的稳定转染： 转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：
lipo2000转染操作步骤(精)
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
细胞核—系统的控制中心练习题
第3节细胞核——系统的控制中心 一、选择题 1.下列有关生物结构及其功能的叙述,不正确的是() A.生物都有DNA和染色体 B.细胞核与细胞质保持连续的物质交换 C.细胞质中的代谢反应最终受细胞核控制 D.染色质和染色体的着色特性相同 答案:A 2.人成熟的红细胞和精子的寿命都很短,这一事实体现了() A.环境因素的影响 B.功能对寿命的影响 C.遗传因素的影响 D.核、质的相互依存关系 解析:此题考查细胞结构与功能的关系,细胞只有保持结构的完整性,才能完成正常的生理功能。人成熟的红细胞没有细胞核,人的精子几乎没有细胞质,没有细胞核的细胞和缺少细胞质的细胞,其寿命都是较短的,细胞都不能正常地完成各项生理功能。 答案:D 3.关于细胞器的界定,目前有两种意见,一种认为,细胞器是细胞内以膜跟细胞质隔离的相对独立的结构。根据这种界定,下列不能称为细胞器的结构是() A.细胞核 B.核糖体 C.内质网 D.高尔基体 解析:核糖体本身无膜结构,根据这种界定,不能称之为细胞器。 答案:B 4.关于细胞核的功能,最能反映其本质的一项是() A.细胞核与生物的遗传变异有关 B.与生命连续性有关 C.细胞进行有丝分裂时核先分裂 D.是DNA储存和复制的主要场所 解析:细胞核内有遗传物质DNA,DNA又在细胞核内进行复制,因此,细胞核是遗传物质储存和复制的场所。而生物的遗传变异和生命的连续性都是遗传物质的功能,二者不能混淆。 答案:D 5.下列不是遗传信息的储存场所的是() A.细胞核 B.线粒体 C.液泡 D.叶绿体 解析:细胞核、线粒体和叶绿体中都有DNA,液泡中没有DNA。 答案:C 6.以下关于细胞核的叙述正确的是() A.核膜为双层膜,外膜的外表面附着有很多核糖体 B.不同的细胞内,核仁的大小和数量都是一定的 C.细胞核内的液体叫做细胞液 D.核孔是包括DNA在内的高分子物质任意通过的通道 解析:在不同的细胞内,核仁大小和数量是不同的。经研究发现,在蛋白质合成旺盛的细胞(如植物的分生组织细胞和肿瘤细胞等)中核仁数目较多,体积较大;而在一些蛋白质合成不活跃的细胞(如精细胞、肌细胞等)中,核仁很小或根本没有(因为核仁与核糖体的形成有关)。核膜上的核孔是某些大分子的运输通道,但细胞核内的DNA分子一般只在核内储存或复制,并不进入细胞质。液泡内的液体叫细胞液。核膜由双层膜构成,外膜的外表面附着有许多核糖体。 答案:A 7.下列细胞中核仁较小的是()
细胞核系统的控制中心教学设计
《细胞核——系统的控制中心》教学设计 广州市真光中学――何红梅[课标要求]：人教版（必修1） 1、阐明细胞核的结构与功能（Ⅱ） 2、尝试建立真核细胞的模型（Ⅰ） [教学目标] 一、知识与技能 1．阐明细胞核的结构和功能以及结构和功能相适应的关系 2．尝试制作真核细胞的三维结构模型。 二、过程与方法 1．通过自主互动的过程式教学，领悟细胞核的功能、细胞核的结构以及功能与结构相适应的关系。 2．培养学生设计实验、分析实验结果的能力。 三、情感态度与价值观 1．通过各实验的资料分析，使学生体验科学工作的方法和过程，增强学生探索新知识的欲望和创新意识。 2．在合作与交流中分享解决问题后的愉悦． [教学重点]： 1、细胞核的结构和功能 2、制作细胞核的三维结构模型 [教学难点]： 1、领悟细胞核是遗传信息库 2、理解细胞核是细胞代谢和遗传的控制中心 [教学方法]：自主探究、师生互动（演示课件） [课前准备]：教师：多媒体课件，导读提纲 ［教材分析］ 本节教材承前面的细胞膜和各种细胞器结构和功能等内容，使学生对细胞的亚显微结构和功能的认识更加全面完整，也为以后的学习作铺垫，如染色质和染色体的关系是学习细胞有丝分裂时染色体变化的基础，细胞核的结构和功能是以后学习遗传的基础，也使学生对“结构和功能相统一”的观念有进一步认识。另外，其中的伞藻实验也让学生体验了生物学研究的一般方法和过程。 ［学情分析］ 经过初中阶段的学习，学生对细胞的整体结构如细胞膜、细胞质、细胞核有了初步认识，这部分内容可以看成是初中教材的补充和深入。通过前面几节内容的学习，学生对细胞各部分结构以及他们的功能有了进一步认识，在脑子中能呈现出细胞亚显微结构的三维图，加深“结构和功能相统一”的观念。
真核细胞转染操作方法
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途： (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建：
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
《细胞核——系统的控制中心》教案
《细胞核——系统的控制中心》教案题目：《细胞核——系统的控制中心》 教学目的：1 阐明细胞核的结构和功能 2 尝试制作真核细胞的三维结构模型 3 认同细胞核是细胞生命系统的控制中心 教学重点：1 细胞核的结构和功能 2 制作真核细胞的三维结构模型 教学难点：理解细胞核是细胞生命系统的控制中心 教学手段：多媒体 课时安排：2课时 教学过程：细胞内部像一个繁忙的工厂，在细胞质中有许多忙碌不停的“车间”，这些“车间”都有一定的结构，如线立体、叶绿体、内质网、高尔基体、核糖体、溶酶体等，这些都是细胞器。我们知道这些细胞器内部进行着有条不紊的生物化学反应，并且彼此之间互不干扰。那为什么细胞能够如此精确而有序的进行这些生物化学反应呢？一个工厂要正常运行，必须要有厂长的正确领导和控制，可以说厂长是一个灵魂人物，是整个工厂的核心，那么在细胞这个工厂中，它的灵魂，控制中心是什么呢？ 一 导入：一个班级中学习生活和日常工作的管理者和指导者是谁？（班主任）一个学校中整体教育教学工作的统领者是谁？（校长） 那么细胞作为一个整体，它的内部时刻进行着有条不紊的化学反应是不是也应该有个控制者呢？——细胞核，今天我们就来学习第三节细胞核——系统的控制中心。 二 新课： 师： 哪一类细胞才具有真正的细胞核？ 生：真核细胞 师：原核细胞中没有成形的细胞核，它的遗传物质集中的区域是？ 生：拟核 师：是不是所有的真核细胞都有细胞核呢？不是的话请你列举出实例。生：哺乳类动物成熟的红细胞就没有细胞核。 师：介绍除极少数细胞外，大多数真核细胞都细胞核；其中少数具有多个细胞核，例如：某种草履虫有两个细胞核（一个与营养有关，一个与生殖有关），人体的骨骼肌细胞含有多个核，大多数的真核细胞都有一
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
转染试剂
自1978年William Linton 先生在美国威斯康辛州麦迪逊市（就是《廊桥遗梦》那里哦）创立Promega以来，今年已经是第26个年头了，也是Promega进驻中国的20周年――这个几乎可以说是国内生物技术最早的启蒙者之一的品牌非常了解国内科研经费来之不易，在进口品牌中以价格算可亲而广受欢迎。Promega的转染试剂产品由于市场定位较准确，获得的业内评价不错，尤其是在其价格经济实惠前提下，产品质量并没有因此打折扣（就是性价比高咯）。 1. siRNA转染试剂 CodeBreaker? siRNA转染试剂是Promega的专利配方产品，专门为有效转染siRNA而优化设计。这一试剂能有效促进siRNA转染哺乳动物细胞，促进基因沉默，而且毒性小，细胞死亡率低，比如转染CHO与HeLa细胞，使用CodeBreaker基因沉默率达到80%或更多，比起同类产品毒性小50%以上。这一产品操作简便，买来后即可使用，不用溶解。将CodeBreaker转染试剂与合适的siRNA二聚物混合后孵育几分钟，然后加到培养细胞即可。而且转染可在完全生长培养基中进行，不需要更换培养基或再加血清，简化了操纵步骤（见下）。CodeBreaker试剂适用的细胞有HeLa、HEK293、293T、CHO 和 3T3细胞等。价格1800/0.4ml，以24孔板为例，按照推荐剂量可以可以做200次，6孔板大约可用40次左右。Day One：细胞铺板 (in complete growth medium). Day Two 1. 将CodeBreaker? Reagent加到无血清培养基中，混合均匀，室温孵育15—20分钟。。 2. 制成复合物：加入siRNA到第二步中，轻微混合。室温孵育15—20分钟。 3. 然后与细胞混合，37°C培育24—72小时，OK，检测吧。 2. DNA转染试剂 Transfast? 是一种特殊的脂质体转染试剂，由阳离子脂类（+） -N,N[bis(2-hydroxyethyl)]-N-methyl-N-[2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl]和中性脂类DOPE（用于加强转染能力）组成。TransFast试剂是干脂膜，一旦水化后就形成多层脂质体，因此也就具有更多优势，尤其表现在可以传递多种生物大分子－－小的从寡聚核苷酸，到质
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1.试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2.弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3.用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2)。
用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4.加入1ml的含血清培养基终止反应。 5.用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6.将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7.用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8.将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9.将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1.转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2.选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3.将混合液在室温放置10―15分钟。 4.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5.加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6.到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。