真核细胞转染操作方法
PEI 转染法
PEI转染法材料：质粒DNA指数生长的真核细胞PEI（聚乙烯亚胺）1×HBS（pH7.4）配方：PEI储存液（100μM）：称取125mg PEI粉末溶解于50ml1×HBS（pH7.4）中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。
1×HBS（pH7.4）：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，过滤（0.2μm滤膜）后储存于4℃备用。
方法：1．细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以4×105至8×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60mm组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。
根据细胞贴壁情况于的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
转染含5％CO2前换入2mL预热的无血清培养基。
2.制备PEI-DNA混合物：以60mm组织培养皿用420μL反应总体积为例。
准备两支1.5mL离心管，一管将质粒DNA（总量2-8μg为佳）加入240μL HBS 中，混匀。
另一管中则用HBS将100μM的PEI储存液稀释成10μM，充分混合。
然后取180μL10μM PEI溶液加入含有DNA的HBS中，充分混匀后室温静置20-30min。
最后将这420μL的PEI-DNA混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％CO的37℃温箱2孵育。
注：每次用100μM的PEI储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的浓度一致。
3.培养6-10h后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16h左右可以观测到报告基因的表达。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:1。
磷酸钙共沉淀将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子.将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染.4。
机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪(biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5。
阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体.这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同.使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA—阳离子脂质体复合物。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
真核细胞转染实验报告
一、实验目的1. 掌握真核细胞转染的基本原理和操作方法。
2. 学习通过转染技术将外源基因导入真核细胞，并观察基因表达情况。
3. 了解转染效果的评价方法。
二、实验原理真核细胞转染是指将外源DNA或RNA分子导入真核细胞的过程。
根据转染方法的不同，可以分为物理转染、化学转染和电穿孔转染等。
本实验采用化学转染方法，利用脂质体介导外源基因进入细胞。
三、实验材料1. 真核细胞：HEK293细胞2. 外源基因：绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒3. 脂质体：Lipofectamine 20004. 实验试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 外源基因质粒制备：将GFP表达质粒用DMSO溶解，配制成浓度为10μg/μl的储备液。
3. 转染：取2孔细胞，分别加入100μl含有10μg GFP表达质粒的DMSO溶液和100μl Lipofectamine 2000溶液，混匀后室温放置5分钟。
将混合液加入细胞中，轻柔混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养6小时。
4. 实时荧光定量PCR检测：转染后24小时，提取细胞总RNA，进行反转录得到cDNA。
以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测GFP基因的表达水平。
5. 激光共聚焦显微镜观察：转染后48小时，观察细胞中GFP的表达情况。
五、实验结果1. 实时荧光定量PCR结果：转染组GFP基因的表达水平明显高于未转染组，表明外源基因已成功导入细胞。
2. 激光共聚焦显微镜观察：转染组细胞中GFP表达明亮，荧光信号明显；未转染组细胞中GFP表达较弱，荧光信号不明显。
六、实验讨论1. 脂质体转染方法具有操作简便、效率较高、对细胞损伤较小等优点，适用于多种真核细胞的转染。
2. 转染效果受多种因素影响，如转染试剂、转染时间、细胞密度等。
HighGene plus Transfection reagent 说明书
HighGene plus Transfection reagent说明书货号：RM09014P规格：1mL，10mL◆产品描述HighGene plus Transfection reagent细胞转染试剂是一种新型的混合型高分子聚合物转染试剂。
它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。
◆产品特点1、适用于多种细胞类型和培养板。
2、高转染效率、批次稳定重复性好、操作简单。
3、转染过程不受血清和抗生素的影响。
◆保存条件-20℃保存，24个月有效。
◆操作说明1、贴壁细胞转染（以293T细胞为例）（1）第一天，将293T细胞接种到6孔板中，细胞密度控制在70%-90%为宜；注：根据实验需求，可以选择不同的细胞培养装置，细胞接种数量和所需培养液体积详见附表1（2）第二天，先取4μg质粒加入到200μL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入8μL HighGene plus转染试剂，吹打混合；注：MEM、1640、F12等基础培养基均可用于HighGene plus转染试剂的溶剂，不同的细胞培养装置所需质粒的量和HighGene plus转染试剂剂量详见附表2（3）将200μL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到6孔细胞培养板孔中，轻轻晃动细胞培养板使其均匀分布；注：6孔板中为完全培养基，轻轻晃动细胞培养板即可，切勿剧烈摇动细胞培养板，以免细胞脱落漂浮！（4）细胞转染4-6h后，半量更换新鲜完全培养基；注：半量换液时，吸弃一半原有完全培养基，补加一半新鲜完全培养基（5）细胞转染24-48h后，即可使用适当方式进行检测，如RT-PCR、Western、ELISA、报告基因等，或加入相应筛选药物（G418或Puromycin）可获得稳定细胞株。
2、悬浮细胞转染（以HEK293F细胞为例）（1）第一天，在125mL摇瓶中接种30mL密度为1×106个/mL HEK293F悬浮细胞；（2）第二天，先取30μg质粒加入到3mL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入60μL HighGene plus转染试剂，吹打混合均匀；（3）将3mL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到30mL体积HEK293F悬浮细胞的125mL摇瓶中，轻轻摇动摇瓶使其混合均匀；（4）细胞转染3-5天后，根据蛋白表达的情况（胞内表达或分泌表达），收集细胞或细胞培养上清，进行后续蛋白纯化操作。
北京普利莱基因技术有限公司DOTAP真核细胞转染试剂使用说明说明书
DOTAP真核细胞转染试剂使用说明C1510描述：DOTAP是一种阳离子脂质体，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。
它以可靠性和高效性著称，是广泛使用的商品化转染试剂。
我们的DOTAP真核细胞转染试剂是由DOTAP 和中性辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液。
这种制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。
DOTAP可高效转染多种细胞，甚至在低浓度血清环境也可工作良好。
它属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，其转染效率高于Sigma公司的DOTAP单体转染试剂，与Invitrogen的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。
转染时只需将稀释的DOTAP试剂与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可加入细胞。
1ml DOTAP可转染100-500µg DNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。
颜色：清亮或略呈白色胶体溶液。
储存：4°C储存12个月。
切勿冻存。
适用：将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。
适用于大多数传代或原代细胞。
转染步骤：以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。
细胞准备：转染前一天传0.5-2x105细胞于24孔板内，加1ml正常培养基培养。
在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为DOTAP转染的最佳时机。
这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。
注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低制备转染复合物：对特定细胞类型来说，应该优化加入DNA(µg)和DOTAP(µl)比率和绝对量，参见后面附表。
推荐DNA和DOTAP 的初始比例为1:4。
DNA(µg)：DOTAP(µl)＝1:2～1:8转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。
cho高效瞬时表达方法
cho高效瞬时表达方法
CHO细胞高效瞬时表达方法是一种用于瞬时转染真核细胞的方法，该方法使用一种重组的腺病毒或质粒载体将外源基因瞬时转染入CHO细胞。
这种方法的优点是转染效率高，能够实现大规模的基因表达和生产，并且可以在短时间内完成实验。
CHO细胞高效瞬时表达方法的具体步骤包括：
1.准备重组质粒或腺病毒载体：将目的基因克隆到质粒或腺病毒载体中，并进行测序验证。
2.转染CHO细胞：将重组质粒或腺病毒载体与CHO细胞混合，通过特定的转染试剂将其导入细胞中。
3.筛选阳性克隆：在转染后的一段时间内，通过特定的筛选方法，如抗生素筛选或荧光激活细胞分选（FACS），从众多的细胞中筛选出阳性克隆。
4.扩大培养：将筛选出的阳性克隆进行扩大培养，以获得更多的目的基因产物。
5.收集产物：在目的基因产物积累到一定量后，收集产物并进行纯化和质量检测。
CHO细胞高效瞬时表达方法的应用范围广泛，可以用于抗体、重组蛋白、siRNA等生物制品的生产和研究。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。
使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。
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一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。
由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：
(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的
情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列
得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。
目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：
克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定
下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
一、试剂准备
1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。
2、核酸贮存液，过滤除菌。
3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。
二、操作步骤
(一)克隆目的基因
1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特异性扩增片段，连入T载体。
3、转化DH5α，质粒制备。
4、酶切初步鉴定，测序证实。
(二) 真核重组表达载体的构建：
pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗
生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。
重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切
回收插入片段和pcDNA3线性片段
T4连接酶连接
转化DH5α
质粒制备
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。
(三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞：
1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。
以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。
进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。
一般要求，6孔培养皿(35mm)，每孔1-2ml培养基3×105细胞。
依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。
典型贴壁细胞平板密度生物科研
3、 SHG-44细胞的转染：
(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。
(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。
① 溶液A：用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μl(30μg/ml)。
②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。
③混合溶液A
和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。
(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)，边加边轻摇培养板。
(4) 37℃孵育6hr。
(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。
(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。
4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。
(一)筛选结果鉴定：
(1)基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
(2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。
(3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算
克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。