真核转染稳定筛选标记及原理
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
什么是转染实验的原理
什么是转染实验的原理
转染实验是指将外源性的基因导入到受试细胞内,使其获得新的生物学功能的一种重要的分子生物学实验方法。
其基本原理是:1. 选取一个适当的载体载体是携带外源基因进入受试细胞的载体。
常用的有质粒、病毒载体等。
载体需要具备携带基因的能力,同时对细胞也要有一定的亲和力。
2. 构建重组载体将需转入细胞内的目的基因连接到载体上,构建成重组载体。
这需要运用一些基因工程手段,如restriction酶切割、连接酶连接等。
3. 转染载体入细胞有多种方法可以将重组载体送入受试细胞,如阳离子脂质体法、电穿孔法、病毒感染法等。
转染后,细胞会吸收载体。
4. 载体在细胞内表达载体进入细胞后,需要在细胞内正确表达,产生目的蛋白质。
需要载体具有组成可自主复制或整合入细胞基因组的能力。
5. 筛选成功的重组细胞不是所有细胞都会转染成功。
需要设计筛选标记,比如赋予细胞抗生素耐药性,然后用含抗生素的培养基进行筛选。
6. 鉴定转染结果需要用一些手段鉴定转染细胞是否获得了新功能,如PCR、Western blotting等检测新基因或蛋白的表达。
7. 分析转染的生物学效果观察转染基因对细胞生长、形态、功能等产生的影响,分析基因的生物学效应,这是转染实验的最终目的。
转染实验可以改变细胞的遗传特性,是揭示基因功能、发展基因治疗等的重要手段。
但每种细胞和基因都有特异性,需要设计针对性的转染方案,并严格验证转染效果。
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
转染、G418筛选、单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
细胞瞬时转染 稳定转染
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程
转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019）1、目的及适用范围该SOP用来建立稳定表达目的蛋白的细胞系。
2、主要仪器及试剂CO2细胞培养箱、生物安全柜、酶标仪、转膜仪、电泳仪、DMEM培养基、胎牛血清、0.025%胰酶、筛选药物（抗生素）3、操作步骤3.1 确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。
3.1.1提前24h在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2细胞培养箱中37℃培养过夜。
3.1.2 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（如：0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/mL），此梯度因抗生素而异。
3.1.3培养10-14d以绝大部分细胞死亡浓度为准,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。
3.2 转染按转染试剂说明书步骤进行。
3.3 转染48h后按1:10的比例将转染细胞传代到6孔板中，换成含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。
在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。
3.3.1滤纸片法：用消毒的5×5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15s，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。
细胞在24孔板中长满后转入35mm培养皿中，长满后再转入10cm皿中扩大培养。
3.3.2有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2～10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔培养板中培养，7-10d后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
3.4 ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
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细胞内DNA的合成途径
细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式
真核细胞稳定转染筛选标记 及原理
小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞 株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表 达稳定。需要长时间的抗性选择培养。
酵母表达系统常用的选择性标记
❖ 营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-，
lys2-。 ❖ 显性选择标记，用于野生型酵母菌
的转染。G418筛选。
哺乳动物细胞遗传性标记
▪ H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料 ▪ A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 ▪ T：胸苷；补救合成dTTP的原料 ❖ 作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键 酶
二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系 统
❖ 遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关 键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
❖ 编码产物：二氢叶酸还原酶（DHFR） ❖ 筛选药物：叶酸类似物——氨基喋呤或氨甲喋呤 ❖ 作用机理：dhfr—缺陷型细胞因不能合成核酸而
1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二 氢叶酸还原酶的催化下合成DNA
2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶 （TK）的催化下补救合成DNA。
胸苷激酶基因选择系统
❖ 遗传标记：TK ❖ 编码产物：胸苷激酶 ❖ 筛选药物：HAT选择法
常用的真核表达系统
❖酵母表达系统 ❖丝状真菌表达系统 ❖昆虫表达系统 ❖哺乳动物表达系统
转 染 方 法
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、 细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是 目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程 序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。 非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物 质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染 具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且 不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质 体介导的转染方法更方便。
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
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死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 ❖ 作用机理：新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解
G418。适因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
转染后的表达
1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，
进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大 部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后 几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上， 出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒 纯度、浓 度和转染效率。
2.稳定表达
转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存 在，转染的细胞可以长期表达。
将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达 XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救 合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆 因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑制 而死亡，以此来筛选阳性细胞。
新霉素抗性基因选择系统
❖ 遗传标记：APH ❖ 编码产物：氨基糖苷磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：新霉素，即G418一种氨基糖苷类抗生素，