质粒转化、细胞转染步骤
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一般普通质粒扩增：先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。
根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。
LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：①取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
②取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30分钟。
③42℃热休克120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。
冰浴5 分钟，然后转移到事先预热至37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时30 分钟。
④用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的LA平板。
⑤铺菌的LA 平板于37℃正放2~3 小时，然后倒置培养16-24 小时。
⑥将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：①将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
②再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
③将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。
然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。
④将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10小时。
[说明]转染详细步骤大攻略
![[说明]转染详细步骤大攻略](https://img.taocdn.com/s3/m/8d4c02e6bb68a98270fefa98.png)
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
转染步骤范文
转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。
转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
以下是转染步骤的详细描述。
第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。
细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。
第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。
化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。
质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。
第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。
转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。
第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。
常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。
通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。
除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。
同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。
总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
质粒转化细胞转染步骤
质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。
一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。
以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。
一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。
它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。
1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。
通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。
孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。
3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。
4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。
同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。
二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。
常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。
1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。
2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。
3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。
不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。
4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。
根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。
5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。
综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。
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质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。