磷酸钙法细胞转染试剂盒
腺病毒操作资料说明
腺病毒操作资料说明
1、AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
2、AD-293 Cells.pdf：腺病毒包装细胞说明书，作为操作指南；
3、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
4、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
5、Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
6、腺病毒扩增和纯化手册.pdf：腺病毒扩增和纯化方法，作为理论学习
7、腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染.doc：腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染操作指南；
8、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；。
磷酸钙法细胞转染试剂盒
磷酸钙法细胞转染试剂盒简介：外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。
Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞转染：1、 在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。
后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2、 在加入DNA 之前2～4h ，加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。
3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
4、 取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
5、 室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
6、 取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。
7、 置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。
8、 去除培养液，用PBS 清洗细胞2次，加入2ml 完全培养液继续培养，一般24h 后可见转染细胞的表达。
(二)悬浮细胞转染：1、 低速离心收集悬浮细胞，用PBS 洗涤1次。
2、 取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
编号 名称CZ0008 100T CZ0008200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃使用说明书 1份3、取BBS solution，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2溶液。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
碧云天C0528 Lipo6000TM转染试剂
Lipo6000TM转染试剂产品简介：Lipo6000TM转染试剂(Lipo6000TM Transfection Reagent)是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。
适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。
Lipo6000TM转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。
Lipo6000TM转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine®2000Reagent完全一致。
并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和Lipofectamine® 2000 Reagent相当甚至略高。
Lipo6000TM转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。
Lipo6000TM转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。
Lipo6000TM转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。
但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。
Lipo6000TM转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。
Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效果比较请参考图1-6。
图1. Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效率的比较。
C0508 磷酸钙法细胞转染试剂盒说明书
磷酸钙法细胞转染试剂盒
产品名称 磷酸钙法细胞转染试剂盒
包装 >200次
产品简介：
¾ 碧云天生产的磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)，在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上 进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
¾ HEK293或HEK293T细胞，即通常所谓的293细胞，是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达 90%以上；通常很容易达到40-50%左右的转染效率。大多数常见的细胞例如Hela细胞、CHO细胞等也都适合磷酸钙法转 染，但效率比293细胞要略低一些。
¾ 本试剂盒不仅适合于大多数贴壁细胞的转染，也适用于一些悬浮细胞的转染。 ¾ 本试剂盒提供的试剂都经无菌处理，可以直接使用。 ¾ 关于不同的细胞转染试剂的主要特点和差异方面的比较，以及如何选择适当的细胞转染试剂，可参考碧云天的相关网
2. 对于悬浮细胞： a) 离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤一次。 b) 按照上面的步骤c)和d)制备DNA-氯化钙-BBS混合物。 c) 每106个细胞的沉淀，用100微升DNA-氯化钙-BBS混合物重新悬浮，室温放置20分钟。 d) 在一个6孔板孔内加入2毫升完全培养液，然后加入来自上一步的细胞-DNA-氯化钙-BBS混合物，混匀。
e) 在含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。 f) 根据实验要求和磷酸钙对于不同细胞的毒性不同，在4-16小时后离心收集细胞，用PBS洗一次，然后用2毫升完全培
养液重新悬浮细胞，继续培养。 g) 通常在转染约24小时后就可以检测到转染基因的表达。
使用本产品的文献：
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
RNA干扰步骤
一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖 1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
各种细胞转染方法比较
GIBCO BRL，Promega
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染，瞬时转染
转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（>65kb）但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少1-20
Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）
CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）
Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）
阳离子聚合物
带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
瞬时转染，特定宿主细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
中国科学院典型培养物保藏委员会
Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达
瞬时性转染，稳定转染
可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
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磷酸钙法细胞转染试剂盒
简介：
外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。
Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
HEK293是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达85%以上，一般的转染效率可达40～50%左右。
其他常见细胞(例如Hela 、CHO 细胞等)也适合磷酸钙法转染，但效率比293细胞要略低一些。
本转染试剂盒主要适合于大多数贴壁细胞的转染，也可于一些悬浮细胞的转染，一般要求DNA 浓度在10～50μg 为宜，Hela 、BALB 等细胞沉淀放置16h ，CHO 、DUKX 、B Ⅱ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。
组成：
自备材料：
1、 胰蛋白酶消化液
2、 完全培养基
3、 PBS
4、 无菌水
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁细胞转染：
1、 在转染前用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达即可进行转染。
后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2、 在加入DNA 之，加入不含抗生素的完全培养液，置于CO 2培养箱培养。
3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃
使用说明书 1份
4、取BBS solution 100μl，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2
溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
5、室温静置，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
6、取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。
7、置于CO2培养箱培养。
如果培养细胞为CHO、DUKX等，可以DMSO或甘油进行休
克处理，转染效率会大大增加，即培养后，用含10%甘油或20%DMSO的完全培养液替换当前培养液，室温下静置，加PBS摇动混匀。
8、去除培养液，用PBS清洗细胞2次，加入完全培养液继续培养，一般24h后可见转染
细胞的表达。
(二)悬浮细胞转染：
1、低速离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤1次。
2、取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution，混匀，即为DNA-CaCl2
溶液。
3、取BBS solution 100μl，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2
溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
4、室温静置，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
5、每106个细胞沉淀用DNA-CaCl2-BBS溶液重新悬浮，室温放置。
6、6孔板每孔加入不含抗生素的完全培养基，取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入
到6孔板中，轻轻晃动混匀。
7、置于37℃5% CO2培养箱培养，去除培养液，用PBS清洗细胞，加入完全培养液继续
培养，一般24h后可见转染细胞的表达。
注意事项：
1、注意无菌操作，尽量避免污染，同时DNA不应含有蛋白和酚。
2、休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。
3、转染12～24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。
4、BBS solution的pH值直接关系到转染效率，尽量避免长时间暴露在空气中，以免被空气中的二氧化碳酸化。
有效期：6个月有效。