HA与HI实验
高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)
高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)试验1.原理：禽流感病毒具有凝集鸡的红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(Hl)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
2.用途：用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定和抗体检测。
3.试剂：禽流感病毒标准抗原、禽流感标准阴、阳性血清、阿氏液、1%的鸡红细胞、pH7.2的磷酸盐缓冲液。
4.设备耗材：普通天平、分析天平、普通离心机、微量振荡器、微量移液器、高压灭菌器、微量移液器、V形血凝反应板、吸头等。
5.操作步骤6.1血凝试验：5.L1取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔〜12孔每孔加25μLPBS;5.L2吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3〜5次充分混匀；5.L3从第1孔中吸取25uL混匀后的病毒液到第2孔，混匀后吸取251IL加入到第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25UL弃之，设定第12孔位PBS对照；每孔再加入25μLPBSo5.1.4每孔加入25μLl%的鸡红细胞悬液（用前将鸡红细胞悬液充分混匀）；振荡混匀反应混合液，室温（20-25。
C）静置40min后观察结果。
5.L5结果判定：在PBS对照出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集，以完全凝集的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。
5.2血凝抑制试验：1.1.11配制4单位抗原：根据血凝试验结果配制4单位抗原，以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4血凝单位抗原即为最高稀释倍数除以4。
加入抗原的血凝滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数为1:64,即ImI抗原加入到63mlPBS中即为4HAU 抗原；1.1.2取96孔V形微量反应板，用移液器在第1〜11孔各加入25ULPBS,第12孔加入50ULPBS；1.1.3第1孔加入25UL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL,第11孔做阴性对照，第12孔为PBS对照。
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸
血凝HA和血凝抑制试验HI
HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
02
血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)是两种常见的检验手段，用于检测血液中是否存在抗体，从而诊断某些疾病或病原体感染。
红细胞凝集试验(HA)
红细胞凝集试验(HA)是一种检测抗体与抗原反应的常规方法。
在这个测试中，医生或实验室技术人员将被测血浆放入红细胞凝集剂中，然后与已知抗原混合，比如病毒、细菌或其他病原体。
如果血浆中含有与已知抗原相应的抗体，那么红细胞就会和抗原结合在一起形成凝集。
如果血浆中没有抗体，红细胞就会分散在凝集剂中。
HA 可以检测出许多病原体的抗体，包括流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和风疹病毒等。
红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集抑制试验(HI)也是一种检测抗体和抗原反应的常规方法。
在这个测试中，被测血液中的抗体与已知抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，在复合物中加入未和抗原混合的红细胞，如果血浆中含有抗体，它们会与复合物结合，使得红细胞不会凝集。
如果血液中没有相应的抗体，红细胞就会在复合物中凝集。
与HA相比，HI适用于检测一些病原体，比如肝炎病毒和流感病毒等，但不是所有病原体都适合使用HI进行检测。
红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）是检测抗体和抗原反应的两种常见方法。
这两种技术可用于诊断许多疾病和病原体感染，但需要在临床实验室或医疗机构进行，由专业人员执行。
尽管这些测试非常有用和重要，但仍需要与其他诊断工具和检查方法相结合，以确保诊断的准确性和病人的治疗。
阐述ha,hi原理和实验流程
阐述ha,hi原理和实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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血凝HA和血凝抑制试验课件
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3. 热灭活法
3.1鸡血清
取100µL血清样品放入一灭菌离心管中；
各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭 菌离心管中；
56℃水浴30min。
3.2 其它禽类血清
血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、 阳性血清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水 浴30min。
4000转离心1min；
取出上清，进行HI试验；
用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性
用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
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2.RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注
意避免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用
三、实验步骤 （以禽流感为例, 参照禽流感防治 技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化
钠0.42g, 加蒸馏水至100mL, 散热溶解后调pH值至6.1, 69kPa 15min高压灭菌, 4℃保存备用。
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•2 1%鸡红细胞液的制备
Hale Waihona Puke 全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高
稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位
实验八病毒的血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验
华南农业大学兽医学院微生物教研室
[目的要求]
1.理解病毒HA和HI试验的原理
2.掌握HA和HI试验的操作方法、结果判 定并了 解其实用价值。
［实验原理］
❖ HA:许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞 的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。HI:血凝现象可以被 特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血 清学试验，称为血凝抑制试验。
100%抑制红血球凝集的血清最大稀释度为血凝抑制价。表中的血凝抑制价为1:128 判定标准：HI血凝抑制价小于或等于8×（3㏒2）判为阴性；等于16×（4㏒2）为可 疑，需复检；大于或等于32×（5㏒2）为阳性。
结果判定：
待病毒对照(11孔)孔出现红细胞100%凝（++++）， 而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可 进行结果观察。
❖ HA
HI
❖ 通过HA-HI实验可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知 病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量
试管法❖ 实验方法微量法[实验材料]
1. 96孔 “V”形微量反应板，移液器，枪头，振 荡 器。
2. 生理盐水，1% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城 疫阳性血清，新城疫阴性血清，待检鸡血清。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一 个血凝集单位。
二、血凝抑制（HI）试验
1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。 例128÷4＝32即 1毫升（抗原）+31毫升（生理盐水）即成。其1个单位抗原孔的红血球 必须达到100%凝集。
HA、HI 试验方法
红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验1．红细胞凝集试验 采用50孔板或试管法按表1，若采用96孔微量板法按表2进行，用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。
将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。
表1 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 血凝素稀释倍数 10 20 40 80 160 320 640 1280…… 0.5生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5…… } } } } } } } } 弃0.5待检抗原 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1%鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.5表2 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 待检抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液2525252525252525252．红细胞凝集抑制试验2.1血凝素凝集价测定 50孔板或试管法按表3，若采用96孔微量板法按表4进行。
表3 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照123 4 5 6 78……血凝素稀释倍数 5 10 20 40 80 160 320 640……0.25生理盐水 0.4 0.250.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25……} } } } } } } } 弃0.25 血凝素 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 1%鸡红细胞悬液 0.25 0.250.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细252525252525252525生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25 252.2 4单位抗原工作液配制及检验2.2.1 4单位抗原工作液配制 选用上述2.1项抗原进行。
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
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实验HA与HI
一、实验原理
某些病毒（如新城疫病毒，减蛋综合症）能凝集某些动物的红细胞，这种现象虽非抗原抗体，但利用这一现象可检查样品中是否有病毒存在，测病毒滴度，病毒红细胞血凝由于能被相应抗体所抑制，因此可以通过病毒的血凝抑制试验测定抗体的效价。
二、实验试剂与器材
1、实验器材
小烧杯、电子天平、离心机、离心管、采血针、玻璃棒、微量移液器（50µl）、枪头（50µl）、培养皿、96孔板恒温箱
2、实验材料
免疫过的鸡
3、实验试剂
3*1 0.9%生理盐水（200ml）称取1.8gNaCl,溶解于200ml蒸馏水中，即可制成
3*2 1%红细胞配制
（1）、取抗体凝血，离心（1000~1500rpm,5min）
（2）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（1000~1500rmp,3~5min）（3）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（3000rmp , 3~5mim）（4）、以红细胞体积，加入生理盐水，制成1%浓度
3*3 抗体制备
（1）、从鸡翅取血，放入离心管中（2000rmp , 3~5min）
（2）、吸取上清，即为抗体（黄色清亮）
3*4 抗原制备
（1）、取新城疫病毒干粉，加生理盐水（灭菌过））、
（2）、溶解，即为抗原
三、实验步骤
1、HA实验步骤
（1）、前10孔与第12孔，每孔加50µl生理盐水
（2）、第11孔加50µl病毒液，第12孔不加，前10空依次倍比
（3）、每孔加入
50µl 红细胞
（4）、放37 ℃恒温箱20min ，观察结果 2、HI 实验步骤
（1）、四单元抗原：取病毒滴度2^n /2^2 ,则取1ml 抗原液，加 入2^(n-2) —1ml 生理盐水。
(2)、前10孔与第12孔每孔加入50µl 生理盐水，第11孔50µl
生理盐水
12
（3）、第11孔加入50µl抗体，前10孔倍比稀释（4）、每孔加入50µl四单位抗原
（5）、放37 ℃恒温箱15min
（6）、每孔加入50µl 1%细胞
（7）、放37 ℃恒温箱15min
（8）、取出观察，记录抗体效价
四、实验结果与分析
1、HA实验结果与分析
（1）实验结果
第7孔
（2）分析
①第3排，第7列红细胞下滑可能是由于洗板的问题
2、HI实验结果与分析
(1) 实验结果
第9孔
（2）实验分析
①取血清时，鸡的血脂太高，或者是由于该鸡血液中蛋白
质含量偏高、血清黏稠，离心后不易分离。
②第7排，第9列红细胞有点凝集可能是红细胞没有混匀
注意事项
（1）1%红细胞配制时洗涤干净并且转速要合适，过高过低都会对结果造成影响
（2）红细胞与4单位抗原从右往左加入
（3）吸取红细胞与病毒液，充分混匀边搅边加
（4）4单位抗原现用现配，此时病毒凝集力强，且较易混匀
（5）在静置过程中，不能振动反应板，在静置过程中轻拿轻放，注意在温箱中放置的温度和时间。
（6）拿出反应板时，立即看结果
(7) 稀释血清时，移液器不能离开液面，防止产生气泡，导致
移液体积不准确。