桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析
桦褐孔菌的研究进展_赵芬琴
・９６・ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ＴＣＭ Ｆｅｂ．２００５ Ｖｏｌ．１２ Ｎｏ．２ 桦褐孔菌的研究进展 赵芬琴，朴惠善 （延边大学药学院，吉林 延吉 １３３０００） 关键词：真菌；桦褐孔菌；化学成分；药理作用；临床应用 中图分类号：R282.71 文献标识码：D 文章编号：1005-5304(2005)02-0096-03 桦褐孔菌，学名为Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ ｏｂｌｉｑｕａ（Ｐｅｒｓ：Ｆｒ．） Ａｏｓｈｉ或Ｉｎｏｎｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ（Ｆｒ．）Ｐｉｌａｔ，俗名为Ｂｌａｃｋ Ｂｉｒｃｈ ｔｏｕｃｈｗｏｏｄ， Ｂｉｒｃｈ ｍｕｓｈｒｏｏｍ， Ｃｌｉｎｋｅｒ ｐｏｌｙｐｏｒｅ， Ｔｓｃｈａｇａ ｐｉｌｚ，Ｃｒｏｏｋｅｄ ｓｃｈｉｌｌｅｒ－Ｐｏｒｌｉｎｇ，Ｋｏｆｕｋｉｓａｒｕｎｏｋｏｓｈｉｋａｋｅ。
属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目（无褶菌目＝多孔菌目，多孔菌科）、褐卧孔菌属（纤孔菌属）。
桦褐孔菌分布于北美（北部）、芬兰、波兰、俄罗斯（西西伯利亚、远东地区、堪察加半岛）、中国黑龙江和吉林省（长白山）、日本（北海道）。
主要分布于北半球北纬４５°～５０°的地区。
生于白桦、银桦、榆树、赤杨等的树皮下或活立木的树皮下或砍筏后树木的枯干上。
桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，引起白桦、银桦、榆树、赤杨等的白腐。
在木材中的桦褐孔菌菌丝在零下４０℃也不会冻死，是极耐寒的种类。
１６－１７世纪以来，东欧、俄罗斯、波兰、芬兰等民间广泛利用桦褐孔菌来防治各种疑难杂症，如各种癌症（胃癌、肝癌、肠癌、各种消化器官癌症）、心脏病、糖尿病。
近年来，对于它的化学成分和药理作用的研究已经日益引起国内外研究人员的重视。
此外，国内外研究者也进行了桦褐孔菌人工培养的研究［１－３］，并发现了桦褐孔菌菌丝生长的最适培养基、最适温度、最适ｐＨ以及最适的碳源、氮源和有机酸源。
桦褐孔菌
3、养分回收浓缩形成颗粒储存。
当桦褐孔菌生理即将成熟时给予外来刺激，便能很快将菌核中积累的营养成份回收、转化、浓缩成坚硬的深褐色颗粒状物储存在菌核内部。所以菌核中的褐色颗粒状物，才是整个桦褐孔菌的结晶，而其余部分较次之。菌核中有无颗粒状物和颗粒状物的多少，也是鉴别桦褐孔菌真伪、优劣的重要标志之一。另外，俄罗斯癌症研究所动物实验报告也证明，采收期不同的桦褐孔菌产品功效会有很大差异。
二、桦褐孔菌生长三步定律研究概述
1、精选培养基，满足菌丝吸收转化的需要。
多年来，国内外研究人工栽培桦褐孔菌者，都认为野生桦褐孔菌绝大多数长在桦树上，桦木屑就是栽培桦褐孔菌最好的原料。而忽略了神秘的桦褐孔菌是在活桦树上才能形成，由桦树不断吸收地下的养分，来供应桦褐孔菌整个生长期的需要。而靠桦木屑中仅存的物质远远不能满足桦褐孔菌的生长发育。单单桦树上产生的桦树液，本身就是理想的营养价值。据《吉林中草药》记载；“桦树液；治痰喘咳嗽。”《黑龙江常用中药手册》记载；“桦树液；治坏血病、肾脏病、痛风，有清热解毒作用。”
桦褐孔菌子实体呈现瘤状菌核，无柄，初期淡白色或淡黄色，渐转变成褐色，干后为暗褐色。成熟时，瘤体内产生褐色颗粒状物，为重要药用部分。桦褐孔菌一般生长在活桦树主杆树皮下，也有生长在榆树、赤杨的树皮下。近年来国内外研究证明，桦褐孔菌中富含多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇，多种三萜类物质等215种之多。其中SOD超氧歧化酶含量为自然界万物之首，每克桦褐孔菌SOD活性酵素含量高达35000单位，是姬松茸的23倍、猴头菇的25倍、灵芝的的55倍、桑黄的318倍、菠菜的250倍。SOD超氧歧化酶是人类生命清除体内自由基，保证生命质量的第一线防御先锋。
一、桦褐孔菌的特性与应用
桦褐孔菌属真菌类的担子菌亚门，非褶菌目Aphyllophorales，多孔菌科Polyporaceae。褐卧菌属Fuscoporia，别名白桦茸，是一种特别珍贵的药食两用真菌。原多生长在北半球北纬45——50度的俄罗斯、芬兰一些地区，我国黑龙江、吉林地区也有生长。
桦褐孔菌β—葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析
桦褐孔菌β—葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析摘要：利用反转录PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）和cDNA末端快速扩增（rapidamplification of cDNA ends，RACE）技术从桦褐孔菌（Inonotus obliquus）菌核中克隆了β葡萄糖苷酶基因的全长DNA序列，命名为IOBGL。
该DNA序列全长3382 bp，其中开放阅读框（ORF）长度为2583 bp，含有13个内含子和14个外显子，编码860个氨基酸，相对分子量为93.4 kD，等电点为5.57，编码的氨基酸序列与地中海嗜蓝孢孔菌（Fomitiporia mediterranea）相似性最高（85%）。
采用实时荧光定量PCR技术研究IOBGL基因在菌核发育过程中的表达量变化，结果表明，IOBGL基因在菌核的发育过程中，表达量呈先上升后下降趋势。
关键词：桦褐孔菌；内切葡聚糖酶；菌核桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又称桦纤孔菌、斜生纤孔菌，俄语名为：Chaga，是一种珍贵的药用真菌，菌核为药用部分[1]，具有增强免疫功能、降血糖和抗肿瘤等多种功效。
桦褐孔菌广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲[2]，在我国主要分布于黑龙江大小兴安岭、吉林长白山区、内蒙古、河北、山西和陕西的天然林内[35]。
目前桦褐孔菌菌核的人工栽培虽然取得成功，但是由于菌核产量低，尚不能进行规模化生产。
所以，提高人工栽培的菌核产量势在必行。
诸多研究表明，纤维素酶活性与子实体的产量密切相关[68]，而β葡萄糖苷酶（betaglucosidase，BGL）是纤维素酶系的主要组分之一，广泛的分布于细菌、真菌和许多动植物体内[9]。
研究发现，BGL参与EMP糖酵解途径，主要是协助其它酶将纤维二糖和纤维素寡糖水解为葡萄糖，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用[10]。
但是，BGL在纤维素酶系中所占的比重最少、活力普遍不高，成为纤维素酶活性的瓶颈。
药食两用真菌—桦褐孔菌
年第 卷 2021 42
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Modified lanostane-type triterpenoids with neuropro-
65
山东畜牧兽医
它对食管癌细胞的增殖起到明显的抑制作用。 3.2 降血糖、降血脂作用
由于生活水平的提高，人类的饮食变得没有 节制，不注重荤素搭配，使得高血压，高血脂不 再是老年人的常发病，青壮年的发生率也在提 高。化疗药的治疗作用和副作用（胃肠道不适、 肝损害等）同时产生，不易长期使用。研究表明 桦褐孔菌多糖对糖尿病鼠、高血脂鼠均有显著的 降血糖[7]、降血脂作用[8]。 3.3 抗病毒、抗炎、抗弓形虫作用
桦褐孔菌化学成分与功能特性的研究进展
CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310
〈综述〉
桦褐孔菌化学成分与功能特性的研究进展
李根培， 朴惠善
（延边大学， 吉林 延吉 133000）
摘要： 介绍了桦褐孔菌在抗癌、预防艾滋病、治疗糖尿病、抗衰老、增强免疫力等方面的研究现状，并对其今后的研 究发展方向进行了展望。 关键词： 桦褐孔菌；药用真菌；功能特性；发展方向 中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2010） 04-0003-03
桦 褐 孔 菌 外 表 面 黑 色 部 分 提 取 物 在 质 量 浓 度 40 μg·mL-1 时， 对人流感病毒 A 和 B 及马的流感病毒 A 有完全的活 性。 抗病毒成分主要是桦木醇、 羽扇豆醇和真菌甾醇。 3.4 防治糖尿病
桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖有降低血糖的作用， 水溶性和非水溶性多糖对糖尿病小鼠都有降血糖作用， 尤 其 是 桦 褐 孔 菌 多 糖 提 取 液 ， 其 降 血 糖 作 用 时 间 可 持 续 48 h。 此外还发现栓菌酸对非胰岛素依赖型糖尿病有效， 其 活性成分主要是各葡聚糖、 杂多糖和蛋白复合物， 菌丝多 糖并没有明显的抗酶特性， 但在给小鼠注射了桦褐孔菌的 菌丝和菌核中提纯的多糖之后其降低血糖的作用维持了 3 h~48 h[22]。 俄罗斯 Komsollllshi 制药公司的桦褐孔菌精粉对 糖尿病的治愈率为 93%。 3.5 其它作用
免疫功能衰退是衰老的最明显特征之一。 在免疫器官 中， 胸腺和骨髓调控的 B 细胞功能及其分泌免疫球蛋白的 能力下降， 这些变化导致中老年人对外抗原的免疫功能减 弱， 对突变的抗原监视功能降低。 现代研究证明， 衰老所 致免疫功能衰退是可以延缓的， 也可以部分恢复。 在防治 免疫功能衰退的诸多措施和药物中， 扶正补益中药已被证 明是有效的。 研究发现， 桦褐孔菌的 水 提 取液 可 使 LDH、 HBDH、 MDH、 GCT 的 活 性 降 低 ， 过 氧 化 氢 酶 的 活 性 增 强， 可清除体内的自由基， 保护细胞、 延长传代细胞的分 裂代数， 增进细胞寿命， 促进代谢， 因而能有效地延缓衰 老， 长期服用可延年益寿[17]。2002 年 Rasina LN 发现， 桦褐 孔菌子实体乙醇提物对 wista 鼠 90Sr 的定位及从体内导出 有积极效果， 能使连续 2 个月受射线体外照射的小鼠平均 寿命延长， 并且使血液中和关键性组织中的脂类过氧化物 的 氧 化 作 用 和 血 清 的 R-蛋 白 质 保 持 在 一 定 水 平 。 Babitskaia VG 等 由 子 实 体 提 取黑 色 素-儿 茶 酚 ， 发 现 其 具 有 抗 氧化和基因保护功能[19]。 2004 年 Yong cui 等报道桦褐孔菌 中含有的水溶性多酚类具有较强的抗氧化作用[20]。 2005 年 崔基成等报道， 桦褐孔菌 （采自长白山山区） 取物对 1,1二苯基-2-苦肼基自由基、 超氧阴离子自 由 基 和 过 氧 自 由 基具有很强的清除活 性[21]。 此外 还 发 现 桦 褐 孔 菌 的 细胞 组 成和继发的新陈代谢都影响用药者的免疫系统， 能有效抑 制传染性病毒， 可预防感冒， 被应用于多种疾病的治疗。
遗传多样性桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析
遗传多样性桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析应用ISSR (inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21株不同的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株进行DNA指纹图谱分析，结果表明：从60条引物中筛选出11条ISSR引物对桦褐孔菌基因组DNA进行了ISSR-PCR扩增，共扩增出DNA谱带183条，其中多态性谱带169条，多态位点百分率为 92.3％，遗传相似系数变化范围为0.605～0.880。
在遗传相似系数为0.763时，可将21个桦褐孔菌菌株划为6大类群，菌株聚类结果与菌株的地理分布有关。
桦褐孔菌； ISSR；遗传多样性桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属多孔菌科（Polyporaceae）、纤孔菌属（Inonotus）,是十分珍稀而又名贵的药用真菌［1］，以其菌核入药［2］。
桦褐孔菌主要分布在东欧的 __、波兰等国家, 我国主要分布于大、小兴安岭和长白山地区，其野生资源已濒临灭绝［3］，人工栽培刚刚起步，很少能获得子实体，而桦褐孔菌育种研究目前尚属空白，从DNA分子水平上弄清不同地理菌株间的遗传关系对该菌的育种具有重要意义。
ISSR (inter-simple sequence repeat)是ZIETKIEWIEZ等在1994年提出的一种锚定SSR的方法［4］，可直接对基因组DNA进行分析，不受任何环境条件影响，操作简单，多态性高，重复性好，被看作是克服了RFLP和RAPD许多局限性的新标记［5］，该技术在灵芝（Ganoderma lucidum）［6］、茯苓（Poria cocos）［7］、毛木耳（Auricularia polytricha）［8］和蜜环菌（Armillaria mellea）［9］等药用真菌遗传多样性分析中已有应用，而利用分子标记对桦褐孔菌遗传差异的研究报道较少。
笔者利用ISSR标记技术，分析了21株不同的桦褐孔菌菌株的遗传差异，旨在为桦褐孔菌的品种选育、资源保护和开发利用等工作提供参考。
桦褐孔菌菌株的分离鉴定及液体优化培养
桦褐孔菌菌株的分离鉴定及液体优化培养作者：郭素萍赵金芬董彩虹来源：《中国卫生产业》2017年第24期[摘要] 桦褐孔菌（Inonotusobliquus）是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，主要分布在俄罗斯、吉林、黑龙江一带。
桦褐孔菌中的多糖有明显的降血糖作用；桦褐孔菌，又称血液血管的清洁剂，对高血压的防治效果显著。
桦褐孔菌化学成分有多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。
该文通过桦褐孔菌的野外采集、收集，分离纯化得到一株桦褐孔菌菌株，经鉴定为桦褐孔菌，代号：F83280（2014）；通过对该菌株的液体发酵优化培养，得到该菌株F83280（2014）液体培养最佳的培养基配方及培养工艺条件，为今后开展药效学研究提供了样品及可靠数据。
[关键词] 桦褐孔菌；新菌株；分离鉴定；液体培养[中图分类号] R931.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）08（c）-0052-04桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。
是一种生于桦树上的药用真菌，其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态。
外表黑灰，有不规则沟痕，内部黄色，无柄，直径25～40 cm，深色，表面深裂，很硬。
菌肉木柱质，有轻微的、模糊不清的环纹，鲜（明亮）淡黄褐色。
桦褐孔菌是前苏联各共和国、波兰、日本等国的民间常用药物，人们已从菌核和菌丝中提取到一种糖蛋白（FIS-1）和一种水溶性多糖（F1），发现均有明显的降血糖作用。
尤其是水溶性多糖（F1），一次性给药50 mg/kg体重，3 h后，高血糖鼠的血糖含量下降近一半，且可维持48 h之久；桦褐孔菌，又称血液血管的清洁剂，对高血压的防治效果显著。
相关文献载：俄罗斯堪索莫乐斯基制药公司生产的桦褐孔菌精粉对高血压的有效率达93%，桦褐芝被广泛应用于2型糖尿病的科研和临床。
野生桦褐孔菌的鉴定及ITS序列系统发育分析
Ｏｎ ｔ ｈｅ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｆ ｒ ｕ ｉ ｔ ｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ｄ ｙ ｍｏ ｒ ｐｈｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎｄ ｉ ｔ ｓ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ，ｗｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｅ ｆ ｄ ｔ ｈｅ ｗｉ ｌ ｄ ｍｅ ｄｉ ｃ ｉ ｎａ ｌ ｆ ｕ ｎｇ ｉ
为桦褐孔菌（ ｂ ｍ ｎ ｏ ｔ ｕ ｓ ｏ ｂ ｌ ｉ ｑ ｕ ｕ ｓ ）
关键词
桦褐孔 菌： 形态学 ； Ｉ Ｔ Ｓ
分类号 Ｓ ７ １ ８ ． ８ １ Ｄｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ Ｉ Ｔ Ｓ Ｐ ｈ ｙ ｌ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｏ ｎ ｏ ｔ ｕ ｓ ｏ ｂ ￣ ｑ ｕ ｕ ｓ ／ ／ Ｈ ｏ ｕ Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ （ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ４ ０ ， Ｐ ． Ｒ ． Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ； Ｓ ｏ ｎ ｇ Ｆ ｕ ｑ ｉ ａ ｎ ｇ （ Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ） ； Ｌ ｉ ｕ Ｘ ｕ ｅ ｆ ｅ ｎ ｇ ， Ｄ ｏ ｎ ｇ Ａ ｉ ｒ ｏ ｎ ｇ （ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ —
桦褐孔菌的研究
桦褐孔菌的研究桦褐孔菌是俄罗斯、芬兰和日本等国常用的民间药物，在我国的知晓率还很低。
近些年来我国也陆续出现了相关的保健产品，但该药物开发和使用多数还是处于切块、打粉的简单使用方式。
桦褐孔菌目前确处于野生资源匮乏、人工栽培研究进展缓慢和开发不足的状况。
标签：桦褐孔菌；白桦茸；野生资源；人工栽培桦褐孔菌是一种寄生真菌，主要寄生于白桦树银桦、赤杨等的树干或树皮下，形成不育的木腐菌。
桦褐孔菌的生物学特征显著，子实体呈现瘤状，直径可达20 cm，黑色，深裂，表面不规则，像砖块；菌肉红褐色，木栓质；菌管3～10 mm，质脆，常前端开裂，菌孔6～8个/mm2，圆形，浅白色，后变暗褐色；孢子阔椭圆状至卵状，光滑，9～10μm×5.5～6.5μm，有刚毛[1]。
16世纪至今，东欧一些国家的民间就用这种菌的菌核来防治癌症。
1桦褐孔菌的分类和分布1.1分类桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、锈革孔菌科、褐卧孔菌属，学名Phaeoporusobliquus（pers：Fr.）J.Schroet.，在外文资料中，其学名常以Inonotusobliquus或Fuscoporiaobliqua出现。
1.2分布桦褐孔菌主要分布于北纬40°～50°地区北美（北部）、芬兰、波兰、俄罗斯（西伯利亚、堪察加半岛以及远东地区）、日本（北海道）及中国，在我国主要分布于黑龙江省和吉林省的长白山地区。
它寄生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木或砍筏后树木的枯干上，木材中的樺褐孔菌菌丝极其耐寒，在-40℃时也可以存活。
2野生和人工栽培现状2.1野生资源现状桦褐孔菌子实体只有在活的桦木上生长10～15年才具有较高的药用价值，且平均每20000棵桦木中只有一棵生长桦褐孔菌，资源十分稀少[2]。
范宇光等以地区分布频度、子实体维持时间、子实体发生频率、子实体发生形式、寄主基物的选择、种型情况、特有情况、保护现状、保护难易程度、人为干扰倾向度、火山危害、生境安全性为评价指标评价了长白山自然保护区38种大型真菌的濒危程度和保护级别，结果表明，桦褐孔菌濒危系数为0.4655，处于濒危等级，优先保护系数为0.6593，属于一级保护等级[3]。
桦褐孔菌中羊毛脂烷型三萜系列化合物的探讨_麦勤勤
ＡＶＡＮＣＥ ４００Ｍ 型 核 磁 共 振 仪 （１Ｈ－ＮＭＲ： ｓ）为 ２６－ＣＨ３和 ２７－ＣＨ３ 两 个 烯 丙 位 的 甲 基 峰。 另
３００ ＭＨｚ，１３Ｃ－ＮＭＲ：７５ ＭＨｚ，德 国 Ｂｒｕｋｅｒ公 司）； 外 可见３．２６（１Ｈ，ｄｄ ，Ｊ ＝４．８，１１．６ Ｈｚ，Ｈ－３），５．１１
了其色谱行为、理化 性 质、波 谱 数 据 等 诸 方 面 的 一 些 （３Ｈ，ｓ），０．８９（３Ｈ，ｓ），０．９９（３Ｈ，ｓ），１．０１（３Ｈ，ｓ）
规律。
５个角甲基的尖峰，这是四环三萜类化 合 物 的 典 型 特
１ 仪器与试剂
征；０．９３（３Ｈ，ｄ ，Ｊ ＝６．４Ｈｚ）为２１－ＣＨ３峰，被２０－ 位 质子偶合而裂分 为 双 峰，１．６２（３Ｈ，ｓ）和 １．７０（３Ｈ，
５ 个 角 甲 基 的 尖 峰；０．９１（３Ｈ，ｄ ，Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）为
２ 提取及分离
２１－ＣＨ３ 峰，１．６２（３Ｈ，ｂｒｓ ）和 １．７１（３Ｈ，ｂｒｓ ）为 ２６－ ＣＨ３ 和２７－ＣＨ３ 两个烯丙位的甲基峰，因 发 生 烯 丙 偶
取桦褐孔菌干燥 子 实 体 粉 末 １ ０００ｇ，用 体 积 分 合而使 峰 展 宽。 另 外 可 见 ３．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ＝４．６，
中 图 分 类 号 ：Ｑ９３６ 文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７２－７６０６（２０１３）０２－０１１２－０５
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｌａｎｏｓｔａｎｅ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＩｎｏｎｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ
ＭＡＩ Ｑｉｎｑｉｎ，ＣＨＥＮ Ｙｉｎｓｈｅｎｇ，ＣＨＥＮＧ Ｌｉｈｏｎｇ，ＳＨＡＯ Ｌｉｌｉ， ＷＵ Ｈｕａｆｅｎ，ＳＵＮ Ｍｉｎｇｌｉ， ＷＵ Ｘｉａｏｈｏｎｇ
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桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析应用ISSR (inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21株不同来源的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株进行DNA指纹图谱分析，结果表明：从60条引物中筛选出11条ISSR引物对桦褐孔菌基因组DNA进行了ISSR-PCR扩增，共扩增出DNA谱带183条，其中多态性谱带169条，多态位点百分率为92.3％，遗传相似系数变化范围为0.605～0.880。
在遗传相似系数为0.763时，可将21个桦褐孔菌菌株划为6大类群，菌株聚类结果与菌株的地理分布有关。
桦褐孔菌；ISSR；遗传多样性桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属多孔菌科（Polyporaceae）、纤孔菌属（Inonotus）,是十分珍稀而又名贵的药用真菌［1］，以其菌核入药［2］。
桦褐孔菌主要分布在东欧的俄罗斯、波兰等国家, 我国主要分布于大、小兴安岭和长白山地区，其野生资源已濒临灭绝［3］，人工栽培刚刚起步，很少能获得子实体，而桦褐孔菌育种研究目前尚属空白，从DNA分子水平上弄清不同地理来源菌株间的遗传关系对该菌的育种具有重要意义。
ISSR (inter-simple sequence repeat)是ZIETKIEWIEZ等在1994年提出的一种锚定SSR的方法［4］，可直接对基因组DNA进行分析，不受任何环境条件影响，操作简单，多态性高，重复性好，被看作是克服了RFLP和RAPD许多局限性的新标记［5］，该技术在灵芝（Ganoderma lucidum）［6］、茯苓（Poria cocos）［7］、毛木耳（Auricularia polytricha）［8］和蜜环菌（Armillaria mellea）［9］等药用真菌遗传多样性分析中已有应用，而利用分子标记对桦褐孔菌遗传差异的研究报道较少。
笔者利用ISSR标记技术，分析了21株不同来源的桦褐孔菌菌株的遗传差异，旨在为桦褐孔菌的品种选育、资源保护和开发利用等工作提供参考。
1 材料与方法1.1供试菌株各菌株编号及来源见表1，其中芬兰菌株由北京林业大学戴玉成教授赠送，日本菌株由日本鸟取大学北本丰教授赠送，其它菌株由长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室保藏。
1.2菌丝体培养取活化的菌丝体，接种于斜面培养基中（20 g葡萄糖，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，0.5 g硫酸镁，0.5 g 磷酸二氢钾，15 g琼脂，加水至1000 mL，pH自然），25 ℃暗培养20 d，待菌丝满管后，收集菌丝，无菌水洗涤2次，用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分，-20 ℃保存备用。
1.3总DNA提取及检测采用改良的CTAB法［10］提取基因组总DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测质量。
1.4PCR反应及电泳引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的ISSR引物序列，由北京英骏生物工程有限公司合成。
PCR反应在MG96G型PCR仪上进行。
PCR反应体系：模板DNA 10 ng/μL，dNTPs 100 μmol/L，引物25 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，Mg2+ 1.4 mmol/L，10 × buffer 2.5 μL，用ddH 2O补至总体积25 μL。
扩增程序为：94 ℃预变性5 min，30个循环：94 ℃变性1 min、45～51 ℃退火1 min（退火温度因不同引物而定）、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用GelDoc-It型凝胶成像系统照相。
1.5数据分析将ISSR图谱以TIFF文件格式保存，有ISSR谱带的计为1，无带计为0，构成ISSR表型矩阵，输入NTSYSpc2.0软件进行分析，计算遗传相似系数，以平均连锁法（UPGMA）进行聚类分析，获得树状聚类图。
2 结果与分析2.1桦褐孔菌遗传多态性分析实验以21个菌株对60条ISSR 引物进行了筛选，其中有11 条引物能扩增出清晰且具多态性的带谱，引物序列见表2。
11条ISSR引物对21个桦褐孔菌菌株共扩增出183条带（表2），其中多态性条带169条，多态位点百分率为92.3％，每条引物扩增出12～20条谱带，DNA片段大小为100～2200 bp。
图2为UBC842引物扩增21株桦褐孔菌菌株DNA的ISSR指纹图谱。
Fig.1 ISSR fingerprinting profiles of I. obliquus strains amplified with primer UBC8422.2桦褐孔菌遗传相似系数分析遗传相似矩阵分析表明，21个桦褐孔菌菌株的遗传相似系数变化范围为0.605～0.880，遗传差异变化较大，说明野生桦褐孔菌的遗传背景较丰富（表3）。
2.3桦褐孔菌UPGMA聚类分析采用UPGMA法对21个桦褐孔菌菌株的遗传相似系数进行了聚类分析，构建亲缘关系树状图。
从图2可以看出，供试菌株的遗传相似水平在0.668～0.882之间，在相似系数为0.67时聚在一起，以0.763为阈值，可将21个桦褐孔菌菌株划分为6大类，FL、ELS、MAFF420102、MAFF420166、CX01、JL01、CX02、JL02、JL03、JL04、JL05聚为类群Ⅰ，其中MAFF420102、MAFF420166亲缘关系最近，遗传相似系数达到0.882，即在遗传组成上有88.2%是相似的；MAFF420101、MAFF420100、MAFF420304、MAFF420279、NBRC9788、NBRC6517聚为类群Ⅱ；HLJ01、MAFF420243、ATCC28281、NBRC8681分别单独聚为类群Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，且日本菌株NBRC8681与其它菌株亲缘关系最远，遗传距离为0.668。
相似系数Similarity coefficient图2 21个桦褐孔菌菌株的ISSR聚类分析图谱Fig.2 UPGMA dendrogram based on ISSR data derived from 21 I. obliquus strains3 讨论ISSR是根据真核生物中广泛存在简单重复序列（SSR）的特点，利用在真核生物基因组中常出现的简单重复序列本身设计引物，无需预先克隆和测序。
简单重复序列通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有良好的稳定性和多态性，有DNA用量少、技术要求低、成本低廉等优点［11］。
本研究所用的11条ISSR 引物均能将供试菌株区分开，表明ISSR分子标记对桦褐孔菌菌株遗传多样性分析是可行的。
聚类分析结果表明，在遗传相似系数为0.772时可将21个桦褐孔菌菌株划分为7个类群，除类群Ⅰ中日本菌株MAFF420102和MAFF420166与采自芬兰和俄罗斯的菌株聚成一个亚类外，其余类群的划分均与地理分布有较强的相关性。
朝鲜的2个菌株与吉林的5个菌株聚为一类，朝鲜与中国延吉接壤，在地理分布上属于同一纬度；日本菌株虽采自一个国家，但地理纬度差异较大，涵盖了不同的生态类型，除在第三类群中没有分布外，在其余各类中均有聚集，表明日本菌株的基因型丰富，遗传多样性较高。
中国菌株HLJ01单独聚为一类，且与日本菌株的亲缘关系较近，中国黑龙江与日本海相邻，更与日本隔海相望，这可能是基因漂变或迁移的结果。
芬兰菌株与采自日本的NBRC8681遗传距离最远，其纬度间隔较大。
实验结果表明，供试的21株桦褐孔菌菌株间的亲缘关系与地理分布相关。
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