各种细胞培养方法

多种细胞的培养方法

HePG2细胞和L-02细胞的传代：

HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株，L-02细胞则是人胎肝细胞株，二者所使用的培养基可以是一样的，即最常见的DMEM。一干使用低糖的。

细胞长满培养瓶时既要传代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度预热，细胞经PBS清洗两遍后，每个中号培养瓶加0.7ml 的胰酶，胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。加入胰酶以后，为使酶的活性最大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。如果在室温情况下消化，时间相应加长，可以在显微镜下观察，当细胞界限已十分清楚，即已分离为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。

16HBE细胞株的传代方法：

镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。20分钟后开始传代。先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml 消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，

分至3个新的培养瓶中，补足培养液。将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。次日观察。

胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养：

细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.

AAV-293细胞的传代:

AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态最好.

用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.

肺癌细胞（人类），其中绝大部分都是贴壁细胞，具体如：

（１）Ａ５４９（肺腺癌）

（２）ＮＣＩＨ４４６（小肺细胞癌）

（３）８０１（非小肺细胞癌）

（４）ＮＣＩＨ４６０（大细胞肺癌）

在消化传代过程中，步骤基本一致：

吸去旧的培养液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一两次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ１０％ＦＢＳ）．

注意：吹细胞时尽量多吹边角儿，此处细胞生长的多．另外吸出细胞前要混匀．另注：消化液的配制方法：

Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g

Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS

小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）：

吸弃原培养液-->PBS洗一两次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->吸弃trypsin 后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸钙-->吸打（枪的吸力调至最小），1：10接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛肾细胞）类型：贴壁细胞

来源：购自武汉病毒所细胞保存中心

由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存

传代步骤：

弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入 ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长

细胞特点:该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到80%,48h不传就会变的很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBK还是很好传的,比以前我传的ST、Vero 细胞等要好传一些，且不那么容易死亡，所以是我的一个比较好的选择！该细胞适合接种疱疹病毒（如：伪狂犬病毒）！

BHK-21：

弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落-------赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染，如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。

补充一点关于BHK-21的培养,先用少量胰酶冲洗一下,弃去,再用胰酶消化1min 左右,效果会好一些

皮肤成纤维细胞和THP-1细胞：

皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。

由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体

覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱落。再分瓶补加培养液。

THP-1细胞的传代就比较简单了。

可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。

目前的方法就这些，希望对新手有所帮助

BHK－21的经验：

吸出培养基，吸得越干净越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培养箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之类得缓冲洗细胞并不绝对必要，我都没有洗，感觉应该洗一下更好，但也更麻烦并增加了污染得可能性。如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前最好预热到37度。由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，我的经验是将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热。消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK－21还是比较好消化的，5－15min

应该足够了，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血亲灭活。一般在T－25瓶中留7－8ml培养基培养。在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。如果使用的培养基偏碱最好先放在CO2培养箱中平衡。细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂），如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多，此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。

几种乳腺癌细胞的培养：

我养的细胞都是乳腺癌细胞，就是以下几种，

1、MCF-7：是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。

2、T47D：也是一种人乳腺癌细胞，培养基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培养方法与MCF-7差不多，但这种细胞传代时间长了会极难养。我曾养过一株新从美国购置的，两三天传一代，长得很旺。后又从国内购买一株时间较长的，要七天传一代，而且很娇气。

3、MA891 鼠乳腺癌细胞：这种细胞比较特殊的是很难消化，容易消化成一团一团的，如果胰酶的量比常用的多三分之一充分预热并放入培养箱中消化就会好的

多。传到15－20代细胞就易长成团，从此生长缓慢，形态改变，需要复苏重养。

95-D细胞的传代:

首先要把0.25%的胰酶和培养液在37度水浴20~30分钟(预热). 从培养箱中拿出培养的细胞瓶(一般我是让它长到90%几再传代的),吸去培养液,可用PBS洗两遍.也可不洗.加入适量0.25%胰酶消化(试瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),让它都浸湿细胞就可以吸去了.等个三十秒就在手上拍打,不要太用劲.就可以看到细胞脱落了,再加入3毫升左右的培养液吹打(这时加的培养液不要太多,否则难吹打成单个细胞!),制成细胞悬液,再传至消毒的培养瓶中(我一般是1传三,三天后又可以传代了)再加入适量培养液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培养箱中培养.

在操作过程中要有酒精灯的,瓶口,镊子等可在火上过一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.无菌观念要强!

胃癌细胞MKN28和AGS：

80%-90%confluency,吸弃原培养液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125％胰酶（10cm）-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->37度消化

5-10min-->以完全培液（RPMI1640+10% FBS-->吸打,1：5接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱培养（5%CO2 ,37度，24h一个周期

L929细胞：

是一种贴壁细胞，贴壁后繁殖迅速，约3－4天传代。切记：不要等到细胞贴的

太满，约70－80％即可传代（细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了BSZLY2003）。否则细胞容易聚团，再想将其打散很不容易，并且打散后细胞的状态也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感觉特好用，胰酶也用过，但不如EDTA好用。以下传代方法同楼上各位朋友。

另外还有一点建议：细胞传代之前用75％酒精棉球擦一擦手。细胞培养瓶打开前也要擦一下，可以降低污染的几率。

SP 2/0：

是小鼠骨髓瘤细胞株，贴壁生长，科室给学生开实验就用此细胞，所用培养基为1640，用小牛血清，浓度15%生长较好。培养孵箱为37度，5%的CO2。

开始将复苏的细胞传到小培养瓶（如25ml)，由于细胞分泌各种因子及细胞间的相互作用，因此生长较快，1-2天就可进行传代（当然要达到80-90%的融合）。消化采用0.25%的胰酶，在显微镜下观察，看细胞形态变圆，而且细胞间界限明显后，或有极少数细胞漂浮起来就可终止消化。

吹打时，动作要轻、快，而且吹管中要吸满液体，这样就不会产生气泡，吹打按一定的顺序进行，将瓶子彻底吹打，尤其是边缘和角落。

传代，先将此瓶细胞只传到一个大瓶中，以保证细胞的数量，小瓶也可保留，继续培养。这样3-4天又可进行传代。

mcf-7细胞株：

本人的细胞株购自武汉中国典藏物培养中心（美国ATCC株亚型），培养基是MEM，10％的小牛血清（购自杭州四季青公司）。传代要看细胞数的多少，一般来说

10％的细胞，要5天左右，如果90％融合的细胞一传2，3天子代细胞即可传代。传代：偶用的是25ml培养瓶，吸出培养基，6mlpbs冲洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均匀盖满瓶壁，消化2－5min左右（可以同时振摇），细胞缩起变圆，浮起，加入培养基2－3ml，不用太精确，吹打成单细胞悬液分瓶即可。室温下消化即可，因为是成纤维细胞，较为耐受胰酶，消化时间稍长亦可，要注意mcf-7细胞是一种肿瘤细胞，生长规律性差，很容易不均匀，要注意吹打的充分性

HSC-T6（大鼠肝星状细胞系）：

弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.05％胰酶消化-->镜下观察细胞变圆（约5分钟）-->以完全培液（DMEM+10% FCS）终止反应-->吹打，1:3 - 1:4接种，然后继续培养。

该细胞系生长速度很快，所以采用1:3 - 1:4接种，而且换液间隔不要超过48h，否则细胞容易脱落下来。

血液病细胞。

如Molt－4,Hl－60等：这些细胞的特点是悬浮生长，传代方便，而且适应能力强——————好养！

当细胞生长到约2—8×10（6）后，即可认为进入对数生长期，此时传代好，一般控制在2－5×10（6）之间最好，此时状态最好。

传代方法：（传代前的消毒处理略）

直接在细胞悬液中加入一定比例的培养基。比例是根据您的实验时间安排而定，

此细胞一般24小时左右可以增长一倍数量，因此，如果现在的浓度为4，您明天要实验，则可1：1传，————2×10（6）。明天同一时间大概就是4左右。hl－60细胞：生长迅速，必须每天观察，因此如果明天您要4×10（6），今天为4，就必须以1：2～3的传。否则明天就已经因浓度太大而不易实验。

因是悬浮细胞，所以观察时以大小，圆不圆，颗粒多少，成团情况，培养基颜色来观察

vero（非洲绿猴肾cell):贴壁细胞，以25ml小方瓶为例，培养液用的是MEM。MEM的配制：10%小牛血清，1%双抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3.

传代方法：

1.倒掉培养液，如果细胞脏的话可用PBS洗两次，否则不用。

2.胰酶0.25%2ml消化1~3分钟，容易消化.

Molt－4：

3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,将贴壁细胞摇至悬浮，并用吸管吹匀，一传三或一传四。

4.放置37度，5%CO2孵箱

Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞）：是一种悬浮细胞：

1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，庆大霉素100IU／ml；

2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；

3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加

入新的培养基就可以进行培养了；

4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。

5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃ 1小时）→液氮。

6、我在做细胞培养时的一些小经验：

（1）细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有拿出来过，我想这样也许会减少污染；

（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；

（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；

（5）在超净台操作前要用0.1％的新洁尔灭或75%酒精擦手

MCF-7细胞：

细胞放在显微镜下观察，细胞无污染、退缩，等其长满培养瓶约70%-80%时即可进行传代操作，具体步骤如下：

1. 打开瓶盖，弃上清,

2.D-HANK‘S夜（以50ml培养瓶为例，下同）2吸管清洗后弃之；

3.加0.25%胰酶2吸管；

4.轻摇晃后置入37度温箱；

5.3-5分钟后置显

微镜下观察，见细胞胞质退缩，变圆；6.吸去胰酶，加含10%FCS的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，见细胞脱落，培养液变混，即可吸出加到新的培养瓶中。注意事项：若胰酶消化超过时间，见细胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10%FCS的RPMI1640，吹打后加到离心管中离心5分钟，再弃上清，加入培养基进行传代

BALB/c-3T3：小鼠成纤维细胞。

消化过程：倒掉培养基——向培养瓶中加入少量37度预热的0.25%胰酶，转动培养瓶使胰酶浸过瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加入量以能覆盖细胞为宜，1分钟后倒掉胰酶——将培养瓶置于37度孵箱中——显微镜下观察，细胞开始变形时以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成单细胞悬液，

1:2~1:3接种，继续培养。

SKOV3细胞传代方法：

自CO2培养箱取出培养瓶－>超净工作台中,以吸管轻轻吹打有细胞的瓶壁，去除生长不好的细胞-->弃去培养液-->加0.04%&<46; EDTA数滴 (用0.02%的EDTA 不易消化掉) ，浸过细胞-->置37℃培养箱10min&<46;左右-->取出，倒置显微镜下观察，细胞变圆回缩，但又未自瓶壁脱落--&<46;>超净工作台中弃去EDTA －>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培养基--&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接种。&<46;

293细胞的传代：

通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在细胞约80%汇合时传代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上浓度的血清DMEM培养液）加上胰酶直接拍打至细胞脱落加入少许培养液中和后分瓶然后补加培养液

5%CO2孵箱 37度培养效果不错

HK2的传代（人肾近曲小管上皮细胞)：

以50ml培养瓶为例

1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，胶头滴管移去培养液，可轻轻吹打，移液时不留培养液残余

2、加0.25％胰酶1ml消化37℃约2min，镜下可见细胞基本圆形脱落，加含血清培养液2ml中止消化，反复混悬

3、移入离心管，1200g，5min

4、弃去上清，加入新培养液5ml，再次吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶，镜下可见散在分布圆形细胞

5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再贴壁

caco-2（人结肠癌上皮细胞）：

将Caco-2 细胞培养于高葡萄糖(的DMEM培养基中( 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine), 培养液含青霉素（ penicillin）10,000U/ml-链霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS)）,长于T-75组织培养曲颈瓶中,通入5%CO2(相对湿度90%),置37℃培养箱中培养。

培养介质2～3天更换一次,当细胞达到90%融合后，以不含钙,镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后与胰酶(0.25%)—EDTA(1mM)于37℃一起孵育至分离(约5～10分钟)。吹打细胞使之脱落，置离心管中1000rmp离心5分钟。细胞重新悬浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培养瓶中。即完成传代。

Bel7402和ECV-304：

37度，5％CO2培养箱。

消化前所用物品75％酒精擦拭后放到超净台上，紫外照射30min，同时胰酶和1640培养液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培养箱平衡，进无菌室开始传代时取出。来苏水托地，整个房间紫外消毒30min。开风淋30min（时间宁长勿短啊，有一次弄得我的脸暴皮！半个月才缓过来）。Bel7402通常都是弃培养液（我通常是倒，觉得用吸管次数多会增加污染的机会，而我老师意见正好相反，郁闷啊），加入少量胰酶清洗，弃去后，加入胰酶2－3ml，培养箱内放置3min左右，取出，加入培养液中和胰酶，轻轻吹打即可。

ECV－304培养条件同时。操作的时候步骤基本相同，只是加入胰酶消化的时间比Bel-7402稍微长1－2min

卵巢癌的细胞：

包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，几种细胞的特性不完全一样，但是我的传代的步骤是基本一致的：细胞生长至80%汇合时传代，先倒掉培养液，加预先加好双抗的生理盐水或PBS 5-10ml（100ml培养瓶）后轻轻摇晃数次后倒掉，

加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均匀（这一点很重要，一定要注意工作台是否平整，否则容易造成胰酶分布不均匀而细胞消化不同步），待细胞间隙变大时终止消化，加含10%血清的培养液（我用的是1640）4ml轻柔吹打，再按照需传代的比例（1：2或1：3）补足培养液后分装至2-3个培养瓶中。若细胞碎片较多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培养液吹打后500rpm离心5min，再用培养液重悬分瓶。消化所需的具体时间依细胞的种类和状态而定，也和细胞的汇合程度有关，一般是80%汇合时最容易消化，若细胞长得太满，消化时间要适当延长，必要时可以将培养瓶移至培养箱内消化。另外，一次性培养瓶要比玻璃培养瓶所需的消化时间稍长。

胰腺癌细胞我所养的是CAP，

感觉不太好伺候，尤其是传代时很困难。我一般是在倒掉培养液后，加生理盐水或PBS冲洗，而后加一次胰酶作用3-5分钟，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶继续消化，这样加两次的效果好一些，但是吹打的时候还是很困难，总感觉细胞的贴壁能力太强了，明明看见细胞已经变圆了，可就是吹不下来。现在想想可能在胰酶中加EDTA会好一些。

CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞。

1、培养液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+链霉素。消化时用0.25%胰酶。

2、我都是1640配营养液时现加血清和双抗，血清分装后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，没发现血清有沉淀现象。总体积100ml的培养液：90ml1640+10ml 牛血清+1ml双抗，无其他物质了。培养过程中没发现有什么问题。

3、传代时，先吸掉培养液，我都不用倒掉的方法，怕由于瓶口而污染，都是慢

慢吸管吸出的。然后培养液略微冲洗一下，加胰酶，倒置显微镜下见80%细胞变圆后，吸出胰酶，培养液终止消化。吹打下细胞，按所需稀释比例传代。我现在的CHO细胞状态不是很好，但是疯长，不知道为什么。所以每次传代时，我都是留一滴足够，差不多能稀释20倍了。不知哪个战友也养CHO细胞，多交流。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代：

RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢，普通的方法根本就不可能将它消化下来，这也是养这种细胞最头痛的问题。现将我的一点心得，简介如下：

消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度

以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

SK-BR-3（乳腺腺癌细胞系）的传代方法：

刚开始养SK-BR-3时，细胞状态不是很好，贴壁也不均匀，于是开始想办法，考虑是不是吹打的不够，或是传得过多，或是其它的什么，后来发现的确如此，细胞的生长状态与传代的方法有很密切的联系。

我的传代方法是：

以50平方厘米培养瓶为例，待细胞长满瓶底70％－80％

1 吸除或倒掉瓶内旧培养基。

2 PBS 5ml加入培养瓶，轻轻晃动培养瓶，让PBS流遍细胞表面，倒掉。

3 PBS 5ml加入培养瓶重复洗一次，倒掉。

4 加入1ml胰蛋白酶消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后置37度5％的二氧化碳培养箱放置5分钟，在显微镜下观察，发现细胞脱壁、变圆即可。

5 加入含血清的培养基5ml中止消化，吸取瓶内培养液，反复轻轻吹打瓶壁细胞，确保所有的瓶底都要吹打到。

6 吸1/3至1/4的细胞悬液接种至新的培养瓶，然后加8ml的新的细胞培养基，置37度5％的二氧化碳培养箱完成传代。

饲养层细胞STO的传代：

1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mLPBS洗一遍

2.0.25%胰酶（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)终止

消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。

3.离心1000rpm*5min,弃上清，加DMEM+10%FBS轻柔吹打。

4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(DMEM+10%FBS)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。

小鼠ES-R1细胞系传代：

因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。

1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul

1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证丝裂霉素分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS 洗两遍（目的是把mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加DMEM+10%FBS后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。

2.第二天早上传干细胞：

（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10%FBS终止消化，轻柔吹打。

（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES 培养液。

（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。

应该注意的问题：

1.STO不管是在ES传代还是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。

2.玻璃管拉得尽量细一些。

3.一定要把mitomycin洗干净

HepG2细胞株的传代经验：

首先在倒置显微镜下观察生长融合达80%，不需要长满，就准备传代。倒掉旧的培养基，再用已经高压灭菌过的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培养瓶，加入1毫升已经配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用

D-Hanks配制后先用滤纸过滤，再用一次性过滤器过滤除菌，再分装成1ml的小包装，刚好每次用完一个，避免每次反复冻存，会使胰酶的活性下降），加入的量以刚好盖满瓶底为宜。放到倒置显微镜下观察变化，一旦发现细胞开始变园收缩，大约1－3分钟时间，必要时可以吹打帮助细胞分散，就立即加入培养基中和胰酶，如有EDTA最好要离心（800rpm,5min)，弃上清夜，再加入完全培养基吹匀，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培养箱，37度培养24小时后观察。

hela细胞的培养条件为:

高糖DMEM培养基,100ml/l胎牛血清;培养液中一般血清含量为10%

传代步骤: 1．倒去细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用顷倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)

2．吸取适量的PBS加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去重复一次,以清于血清成分, 利于胰酶消化

3．加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml，15cm培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。

翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去

消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作4．加入适量培养液终止消化

吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下轻轻吹打，混匀，成细胞悬液取样计数，调整细胞浓度为5′10 /ml

15cm培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好,置37°C孵箱中培养。

传代的天数要以HELA细胞的生长密度为基础,细胞密度大了就要传,应该每天观察HELA细胞,注意其生长状态.HELA细胞的生长分5期:

游离期

细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。

吸附期

接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。

繁殖期

细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。

维持期

细胞形成单层后生长与分裂减缓、折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，CO2增多，培养液变黄。

衰退期

如不及时换液和传代，由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多,立体感差，细胞皱缩、脱落、逐渐衰老死亡。