基因工程课后习题答案

2.质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA乍为载体的主要特征是什么

为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外

源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记

3 •如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义

质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细

胞内.

4.列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和 cos质粒的不同用途

表达质粒：在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞

中复制并检测。

探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。

cos质粒：人工构建的含有入DNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。

5.II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么

分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识

别序列中或靠近识别序列

7. KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别

DNA聚合酶I包括大片段（klenow片段）和小片段

功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了 5'一3'核酸外切酶活性，两者都具有5'一3' DNA聚合酶活性和 3'T 5'核酸外切酶活性。

8影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？

温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和

微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性

9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接

在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，

速度也慢。因为一个平头末端的5'磷酸基团或3'羟基与另一个平头末端的 3'羟基或5'磷酸基团同时

相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度比粘性末端慢10-100倍。

11•为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞

野生型细菌有针对外源 DNA的限制和修饰系统，外源 DNA会被识别，从而被降解，要选择限制系统缺陷型的受体细胞（限制缺陷型）；外源基因克隆、扩增以及表达是建立在DNA重组分子自主复制的基础上的，受

体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的受体细胞（重组缺陷型）；用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA 分子具有较高的可转化性，利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，从而提高其转化率（转化亲和型）

13.简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略载体遗传标记检测：抗药性检测，营养缺陷型检测；显色筛选

14.探针、引物、接头的物质基础和用途分别是

探针：小段单链DNA或 RNA序列可以是已知的或未知的，带有标记（放射性 /非放射性），用于检测与其互补的核酸

序列；

引物：小段单链DNA或RNA序列是已知的，长度为 16-30bp，作为DNA复制的起点

接头：平头双链DNA更换粘性末端

15.简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围

鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体 DNA上，转化

受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选岀含有目的基因的期望重组子。为保证覆盖整个基因组，需要测远远超过基因组大小的序列；适合较小的基因组；测序后需要填补一些空白；适合没有重复序列的基因组，如果有大量的重复序列，不能保证正确的组装。

cDNA法 :获得mRNA除去内含子

PCR法，知道基因的两侧序列或中间序列

化学合成法，知道全基因序列，小片段连接法，补丁延长法，大片段酶促法

16.简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。

基因文库：基因组文库和 cDNA文库

基因组文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。

cDNA文库：由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库

一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组 DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。

构建技术：载体：2-DNA和考斯质粒，装载量大（待克隆DNA随机片段的大小应与所选用的载体装载量

匹配）

用机械断裂（超声波冲击）或限制性内切酶部分酶解整个基因组DNA，得到大量的DNA片段，将这些片

段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。

cDNA构建技术：

载体：普通质粒（表达型），受体细胞：大肠杆菌（繁殖迅速，易于保存，克隆操作简便，转化效率高）

提取细胞内总RNA，用Oligo（dT）探针分离其中的 mRNA，经反转录形成cDNA，将单链cDNA变成双链, 用合适的限制性内切酶进行酶切，与载体相连，转化宿主菌，挑选阳性克隆，形成文库第三章