7第七章 免疫电泳技术
免疫电泳欧洲药典方法
免疫电泳欧洲药典方法免疫电泳是一种常用的生化技术，主要用于检测和分离生物物质中的蛋白质。
它利用特定的抗体与目标蛋白质结合，然后将混合物经过电泳分离，最终可以得到目标蛋白质的电泳带。
1.实验材料和仪器：(1)免疫反应液：包括抗体和相应的检测抗体。
抗体应根据检测对象而定。
(2)电泳缓冲液：主要成分为三种：阴极缓冲液、阳极缓冲液、以及样品缓冲液。
(3)聚丙烯酰胺凝胶：通常使用的是聚丙烯酰胺胶。
根据目的不同，可以使用不同的凝胶浓度。
(4)电泳槽：通常使用平行电泳槽，根据凝胶的大小而定。
(5)电源：应根据凝胶的大小和浓度而定。
(6)图像分析装置：可以使用特定的电泳成像系统或扫描仪。
2.操作流程下面按照方法的不同部分来介绍免疫电泳的操作流程：(1)制备聚丙烯酰胺凝胶将所需的丙烯酰胺浓度(通常为5-15%)的缓冲液混合并加入过氧化物溶液，用n-丙基氨基甲酸酯作为交联剂，混合均匀后倒入模板中，待凝固后取出。
(2)制备免疫反应液先制备检测蛋白质的抗体。
一般来说，公司会提供来自不同物种的抗体，可以根据需要选择。
取抗体适当稀释后，加入检测蛋白质，进行共价结合。
将合成的免疫反应液加入到聚丙烯酰胺凝胶中，等待反应。
(3)电泳操作准备好阴极和阳极缓冲液以及样品缓冲液，根据需要加入适当的试剂比如十二烷基磺酸钠等，混合均匀。
将聚丙烯酰胺凝胶浸泡在样品缓冲液中，待浸透后放入电泳槽中。
准备好电源，先进行预运行(pre-run)，预运行时，将电压调至适当值，电泳板子在有效距离内开启电源，维持约30分钟(根据不同的操作，时间需调整)。
预运行完成后，准备抗体，向凝胶中注入抗体，然后开始运行电泳。
(4)电泳后的分析和影像运行电泳后，需要进行染色和成像(通过特定的电泳成像系统或扫描仪)。
将凝胶浸泡在染色缓冲液中，待染色足够后(根据染色液种类，时间需要调整)，将凝胶安装在导轨上，进行成像。
3.免疫电泳的优点免疫电泳是温和的，不会破坏蛋白质分子结构，也能检测蛋白质的质量和纯度。
免疫学实验 对流免疫电泳
1
Ab
2 Ag
3
Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照）
2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清
电泳
• 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
实验二 对流免疫电泳
一、实验目的 1.掌握对流免疫电泳的原理。 2.掌握对流免疫电泳检测待测抗原的方法。
二、实验原理
• 对流免疫电泳实质上是定向加速的双向免 疫扩散技术。
• 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电 荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由 于分子量大，暴露的极性基团较少，在离 子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影 响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比 例处形成乳白色沉淀线。
四、实验步骤
• 琼脂糖凝胶板的制备 • 打孔、加样 • 电泳 • 结果观察 • 影响结果的因素
制板、加样、打孔
• 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片 上,待凝。
• 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm), 如图。
• 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔 内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但 不能溢出
五、结果和讨论
• 将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
甲胎蛋白检测意义：
免疫电泳的原理及其应用
免疫电泳的原理及其应用1. 前言免疫电泳是一种结合了免疫学和电泳技术的分析方法。
它通过利用抗体与抗原结合的特异性，将分子在电场中分离出来，从而实现对抗体或抗原的检测、定量和鉴定。
本文将介绍免疫电泳的原理及其在生物医学领域的应用。
2. 免疫电泳的原理免疫电泳的原理基于抗体与抗原之间的特异性结合。
它包括两个主要步骤：样品制备和电泳分离。
2.1 样品制备样品制备是免疫电泳的关键步骤之一。
首先，需要将待测的抗原或抗体与荧光标记物或酶标记物结合，以便在电泳分离过程中进行可视化或检测。
其次，待测样品需要被加入到电泳凝胶中，通常是聚丙烯酰胺凝胶。
最后，样品需要经过适当的处理步骤，如加热、洗涤等，以去除多余的杂质。
2.2 电泳分离电泳分离是免疫电泳的核心步骤。
已经准备好的样品被注入到凝胶中，然后在电场的作用下，分子根据大小、电荷和形状等特性在凝胶中进行迁移。
通常，较大的分子会迁移得更慢，而较小的分子会迁移得更快。
这种差异性使得我们能够通过电泳分离来检测和鉴定待测的抗原或抗体。
3. 免疫电泳的应用免疫电泳在生物医学领域有广泛的应用。
下面将介绍一些常见的应用领域。
3.1 免疫疾病诊断免疫电泳可以用于各种免疫疾病的诊断，如自身免疫性疾病、感染性疾病等。
通过电泳分离样品中的抗体或抗原，可以确定其类型、数量和结构等信息，进而为疾病的诊断提供依据。
3.2 肿瘤标志物检测免疫电泳可以用于肿瘤标志物的检测。
肿瘤标志物是一种在体内产生的特定蛋白或分子，其水平的变化可以反映出肿瘤的存在和发展。
通过免疫电泳，可以对肿瘤标志物进行定量检测，为肿瘤的早期筛查和治疗提供重要的信息。
3.3 药物研发免疫电泳在药物研发中也有重要的应用。
通过免疫电泳，可以评估新药物与抗体的结合情况，从而确定药物的活性和特异性。
这对于药物的筛选、研发和优化至关重要。
3.4 免疫学研究免疫电泳在免疫学研究中发挥着关键作用。
它可以用于研究抗体与抗原的结合机制、免疫应答的调节以及免疫疾病的发生机制等。
免疫固定电泳类型
免疫固定电泳类型免疫固定电泳是一种基于蛋白质抗原抗体相互作用的电泳技术。
它可以用于检测和分离复杂样品中特定的蛋白质或抗原，并在免疫学研究、诊断和治疗等领域发挥重要作用。
一、基本原理免疫固定电泳基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在电泳过程中，样品中的蛋白质或抗原首先与适当的抗体结合形成免疫复合物。
然后，这些复合物被固定在电泳胶的特定位置上，通常是通过加热或固定剂交联等方法。
最后，经过电泳分离，抗原或蛋白质可以根据其大小、电荷等特性在胶上形成特定的带状图案。
免疫固定电泳可以分为凝胶免疫固定电泳和聚丙烯酰胺凝胶免疫固定电泳两种类型。
二、凝胶免疫固定电泳凝胶免疫固定电泳是最早应用的免疫固定电泳技术之一。
在凝胶免疫固定电泳中，通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质。
凝胶中的蛋白质或抗原与抗体结合后，通过电泳在凝胶中分离。
凝胶免疫固定电泳常用于检测和分离血清中的特定蛋白质，如免疫球蛋白。
三、聚丙烯酰胺凝胶免疫固定电泳聚丙烯酰胺凝胶免疫固定电泳是一种改进的免疫固定电泳技术，它使用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质。
与传统凝胶免疫固定电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶免疫固定电泳具有更高的分辨率和更好的灵敏度。
该技术可以用于检测和分离多个蛋白质或抗原，并在研究复杂样品中的蛋白质亚型、同工酶等方面发挥作用。
四、免疫固定电泳的应用免疫固定电泳在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 免疫学研究：免疫固定电泳可用于研究抗原与抗体相互作用、分析免疫球蛋白亚型、研究免疫反应等。
2. 诊断：免疫固定电泳可用于检测血清中的特定蛋白质，如肿瘤标志物、免疫球蛋白、抗体等，从而在疾病的早期诊断和治疗中发挥重要作用。
3. 药物研发：免疫固定电泳可用于评估药物的药效和毒性，研究药物与蛋白质的相互作用，从而指导药物研发和临床应用。
4. 免疫疫苗研究：免疫固定电泳可用于评估疫苗的免疫原性和效力，研究疫苗与免疫系统的相互作用，从而改进疫苗的设计和生产。
【教学】第7章_第4节_分子杂交和印迹技术(3_LMJ)'
2021/7/13
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（三）其他核酸杂交方法
3.膜上分子杂交*
方法：
将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤 维膜)，这种膜只吸附单链DNA；
用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可 使DNA变性吸附在膜上；
用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子 DNA预杂交。
膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中
2021/7/13
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(2) DNA随机引物标记法
使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow 酶的作用下，合成DNA探针。
合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中 模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度 为400-600个核苷酸。
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DNA随机引物标记法示意图
与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。
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（一）常用探针的种类
寡核苷酸探针
DNA探针 基因组DNA探针
探针的种类
cDNA探针
RNA探针
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1．DNA探针
双链探针:
从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备； 优点则是容易制备。
最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。
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DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
医学免疫学：免疫电泳试验
既有电泳分离技术的快速、灵敏和高分辨力， 又有抗原抗体反应的高度特异性。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。
停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
实验原理
根据沉淀弧的数量、位置和形态与已知标准抗原 抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测样品中 所含的抗原成分的种类和性质。
主要的试剂和器材
• 人全血清 • 兔抗人全血清 • 1.5％琼脂、0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液 • 移液管 • 玻片、刀片、打孔器 • 电泳槽、电泳仪、水浴箱
所用抗血清最好用两只或两只以上免疫动物的混合血清， 增加抗血清的抗体谱。
浇板时要求厚度均匀，无气泡。打孔挖槽时要求外壁整齐， 防止琼脂破裂。
扩散过程中需要在不同时间进行结果观察，做好记录。 每次电泳后应倒换正负电极或将两槽缓冲液混合后再使用。
双扩散 取出电泳后的琼脂板，挑出中间槽内的 琼脂，取100μι兔抗人全血清充满槽内，注意勿 外溢。将琼脂板放于湿盒内，水平置于37℃水 浴箱中进行双扩散，18-24h后观察结果。
实验结果
观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。
注意事项
抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉 淀线。当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后 再进行电泳和扩散。
实验步骤
制板 将洁净玻片置于水平台面上，用移液管吸取 4-4.5ml熔化的1.5％琼脂加于载玻片上，待冷凝。
2-5mm
分子生物讲义：第七章 分子生物学常用技术
（三）聚丙烯酰胺凝胶优点
本法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种 酶反应，如合成放射性核素探针，进行限制性 酶切割等，但操作时需严格控制熔胶及电泳温 度，应分别<65℃及<30℃。
（2）透析袋电洗脱法
电泳完毕后，于紫外灯下切下拟回收的DNA区 带，将凝胶条置于含有适量缓冲液的透析袋中， 再放入电泳槽电泳30~60分钟（6~10V/cm）， 使DNA分子泳动到透析袋靠正极一侧的壁上， 然后反向电泳 30~60秒，使粘在透析膜上的 DNA分子泳动到袋PH为8.0内的缓冲液中。吸 出袋内的缓冲液并用正丁醇抽提或乙醇沉淀所 需的DNA分子。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体－丙烯酰胺（Acr）在催化剂N,N,N',N'－ 四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的作用下，发生聚合 反应，形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，链间通过交联 剂－N,N'－亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接最终形成具有三维网 状结构的凝胶。凝胶网孔的大小取决于聚合链的长度及交联度。 聚合链的长度决定于聚合反应中单体丙稀酰胺的浓度，交联度则 决定于单体与交联剂的相对比例，其中交联剂浓度愈高，形成凝 胶的孔径愈小。因此，通过控制单体浓度及单体与交联剂的比例， 制备孔径大小不同的凝胶。
本法适用于小于5kb的双链DNA分子的回收， 回收的DNA纯度很高。
（三）琼脂糖凝胶电泳应用范围
琼脂糖凝胶电泳主要用于DNA的分离、 纯化和鉴定，如用于重组基因的分离、 鉴定、限制性酶切图谱分析、Southern、 Northern、Western杂交分析，以及PCR 产物的分离鉴定等等。几乎所有分子生 物学研究工作都离不开凝胶电泳这一最 基本的实验技术 。
免疫电泳的原理和应用
免疫电泳的原理和应用1. 原理免疫电泳是一种基于抗原与抗体特异性反应的电泳分析技术，通过构建电泳系统和选择适当的电泳缓冲液，可以实现对抗原和抗体的分离和检测。
其原理主要包括以下几个方面：1.抗原-抗体反应：免疫电泳基于抗原与抗体的特异性结合反应。
当样品中存在目标抗原，与之特异性结合的抗体会与抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
2.电泳系统：在免疫电泳中，通常使用的电泳系统包括凝胶电泳和电泳板电泳。
凝胶电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶作为固相介质，而电泳板电泳则是在电泳板上直接进行电泳分离。
通过在电泳系统中施加电场，可以使得抗原-抗体复合物在凝胶或电泳板上移动。
3.电泳缓冲液：电泳缓冲液的选择对免疫电泳的分离效果具有重要影响。
一般情况下，电泳缓冲液需要包含适当的pH值和离子浓度，以提供理想的分离条件。
另外，一些特殊的缓冲液也可以添加某些化学物质，如凝胶强化剂、离子交换剂等，以优化分离效果。
4.可视化方法：免疫电泳的可视化方法通常用于观察和分析电泳结果。
典型的可视化方法包括染色、自动扫描、Western blotting等。
这些方法可以帮助确定抗原和抗体的分离情况，从而实现对样品中目标物质的检测和定量。
2. 应用免疫电泳作为一种敏感而特异的分析技术，在生命科学和临床诊断领域得到广泛应用。
它可以用于检测和分析各种不同类型的抗原和抗体，有助于研究和诊断多种疾病。
以下是免疫电泳在不同领域的应用：2.1 免疫学研究免疫电泳可用于分析和检测多种免疫学相关的物质，如抗体、细胞因子等。
通过免疫电泳技术，可以实现对不同血清样品中抗体的检测和比较，从而研究免疫系统的活性和变化。
此外，免疫电泳还可以用于研究免疫血清的组成和结构，为疫苗的开发和免疫疗法的设计提供重要信息。
2.2 临床诊断免疫电泳在临床诊断中具有重要作用。
它可以用于检测某些疾病的标志物，并帮助诊断和监测疾病的进展。
例如，在肿瘤学中，免疫电泳可以用于检测肿瘤标志物的存在和浓度变化，为肿瘤的筛查和治疗提供重要依据。
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第七章免疫电泳技术
本章考点
1.概述
2.免疫电泳技术
3.应用
免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。
第一节基本原理
一、原理
免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。
它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。
由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。
当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。
二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗
蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH
小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。
在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。
在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。
电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。
三、常用载体
有琼脂和琼脂糖凝胶。
其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。
第二节常用技术
免疫电泳常用技术有：
1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。
通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。
图23 对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性
2.火箭免疫电泳：火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。
实质上是加速度的单向扩散。
当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比例时。
形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭状沉淀，峰形高度与抗原量成正相关。
当琼脂中抗体量固定时，以不同浓度的抗原泳动的沉淀峰高度绘制标准曲线。
图24 火箭电泳
（1）（2）（3）为标本
（4）（5）（6）为标准抗原
3.免疫电泳：是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术。
检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2.0mm宽的小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同，分离成若干肉眼不可见的区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，根据抗原电泳位置、含量及与抗体比例不同，而出现不同位置、不同形状和不同大小的沉淀线。
待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品的成分及性质进行分析。
此技术为定性试验，目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定。
图25 免疫电泳示意图
4.免疫固定电泳：这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。
检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上。
参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。
孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。
经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。
第三节免疫电泳技术临床应用
免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面；火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定μg／ml以上的含量，目前较多应用于放射自显影技术；免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定，此外免疫固定电泳也用于尿液中本周蛋白的检测及κ、λ分型、脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。
习题38 在对流免疫电泳中，抗体向阴性移动的原因是
A.抗体带正电
B.抗体带负电
C.扩散作用
D.电泳作用
E.电渗作用
[答疑编号500728070101]
『正确答案』E
『答案解析』通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
习题39 对流免疫电泳沉淀线出现在抗体阳极一侧，说明
A.抗原强阳性
B.抗原阳性
C.抗原弱阳性
D.抗原阴性
E.与抗原抗体无关
[答疑编号500728070102]
『正确答案』A（见解析）
『答案解析』
对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性。