免疫双扩、免疫电泳实验
免疫双扩散实验报告
免疫双扩散实验报告实验目的本次实验的目的是通过普尔钦斑实验，观察和分析金属在不同浓度的硫酸溶液中的腐蚀现象，研究金属的耐腐蚀性能。
实验原理普尔钦斑实验是一种常用的评价金属耐腐蚀性能的方法。
实验中，将金属试样置于不同浓度的硫酸溶液中，观察其表面是否产生普尔钦斑或者其他腐蚀现象。
普尔钦斑是由于金属表面部分区域缺乏保护性的氧化膜而发生的电化学腐蚀。
实验材料和设备- 金属试样（铁、铜、铝等）- 实验盒- 硫酸溶液（不同浓度）实验步骤1. 准备实验盒，并将其清洗干净。
2. 准备不同浓度的硫酸溶液，如5%、10%、15%等。
3. 将金属试样放置于实验盒内，并分别注入不同浓度的硫酸溶液。
4. 观察金属试样的表面，记录下是否产生普尔钦斑或其他腐蚀现象。
5. 完成观察后，将金属试样取出，用清水冲洗干净并进行干燥。
实验结果与分析实验中使用的金属试样分别为铁、铜和铝。
观察不同浓度的硫酸溶液中金属试样的表面，得出以下结果：1. 铁试样：在5%浓度的硫酸溶液中，铁试样表面未发生明显的腐蚀现象；而在10%以上的浓度下，铁试样表面出现了普尔钦斑，随着浓度的增加，普尔钦斑的数量和大小也增加。
2. 铜试样：铜试样在5%浓度的硫酸溶液中无明显腐蚀现象，但在10%以上的浓度下，铜试样表面开始出现腐蚀现象，但无明显的普尔钦斑。
3. 铝试样：铝试样在5%和10%浓度的硫酸溶液中无明显腐蚀现象，但在浓度达到15%以上时，铝试样表面出现了片状的腐蚀和普尔钦斑。
通过以上结果分析，可以得出以下结论：1. 铁的耐腐蚀性能较差，容易在高浓度的硫酸溶液中发生腐蚀。
2. 铜的耐腐蚀性能相对较好，在低浓度的硫酸溶液中不容易发生腐蚀。
3. 铝的耐腐蚀性能较为优良，只有在浓度较高的硫酸溶液中才有可能发生腐蚀和普尔钦斑。
这些结果可以为我们在实际工程应用中选择合适的材料提供参考。
实验结论通过本次普尔钦斑实验，观察了三种不同金属在不同浓度硫酸溶液中的腐蚀表现。
根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 铁的耐腐蚀性能较差，在高浓度硫酸溶液中容易产生普尔钦斑。
免疫沉淀类试验——双扩、免疫比浊1解析
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
③不宜用于药物等半抗 原的测定；
④灵敏度较散射比浊法 低。
2 散射免疫比浊法
原理：
散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到 小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转， 这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同 而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角 度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复 合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复 合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散 射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比 浊法(endpoint nephelometry)。
沉淀反应
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
是可溶性抗原与相应抗体在 适当条件下发生特异性结合所出 现的沉淀现象。
分类
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
反 应
单向免疫扩散试验 免疫扩散
双向免疫扩散试验
凝胶内沉淀试验
免疫电泳
火箭免疫电泳 对流免疫电泳
沉淀反应的特点
• 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖 • 沉淀反应分两个阶段：
– 第一阶段、抗原抗体特异性结合 – 第二阶段、形成可见的免疫复合物
免疫浊度测定
经典的沉淀试验有4个缺点无法克服： ① 操作繁琐 ② 敏感度低（10～100μg/ml） ③ 时间长 ④ 难以自动化
双向免疫扩散试验
1.双扩散用于疾病诊断： 以IBD诊断为例，中心孔加 IBD标准阳性血清，周围孔 分别加IBD标准抗原、生理 盐水、待检抗原1.2.3.4。
2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡IBD抗体检测为例， 中心孔加IBD标准抗原，周 围孔分别加IBD标准阳性血 清、IBD阴性血清、待检血 清1.2.3.4。
D. 沉淀带形成一种特异性的半渗透性屏 障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允 许不同的分子通过。
沉淀线的特征与位置：
1 抗原、抗体的特异性和浓度，
2 抗原、抗体分子的大小
3 扩散率
当抗原体存在多种成分时，将呈现多条 沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗 原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗 原之间的异同点，因而应用范围较广。
以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。电 泳前各孔中加入抗原液，每孔20μL。
4．电泳：250伏1.5小时（滤纸搭桥）
5．结果判定
电泳结束后，取出琼脂板，加1％鞣酸 生理盐水浸泡后30分钟，观察与测定结果。
四 结果
五 讨论
试分析沉淀峰出现云雾状或圆形的原因 及解决方案。
三 操作步骤
1．琼脂玻板的制备梅花型打孔图 将溶化的1.5%琼脂倒在培养皿中，使之
能将表面覆盖，制成厚度约2～3mm厚的琼脂 糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔。 （切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡 的出现。）
2．免疫扩散及结果观察
每孔加入 抗原/抗体10μl
注意：加样至孔满为止， 不可外溢。待孔内液体渗 入凝胶后即可放于温盒中。 湿盒于37℃中，一般保温 24～48h，观察抗原抗体
产生的白色沉淀线。
四 结果记录
A
Ag Ab
五 讨论
BCDEF
实验三 琼脂免疫电泳实验
注意事项
（1）浇载玻片时，玻片应保持水平，琼脂 面要尽量铺平。 （2）加样应一次加满，并防止样品溢出孔 外。 （3）电泳过程中注意防止发热，以免影响 电泳结果。 （4）电泳时要使滤纸与凝胶密切接触， 不可有缝隙。
思考题
（1）画出沉淀线的形态、数量和位置，并予以 简要说明。 （2）与相关的免疫学试验进行比较，探讨免疫 电泳的主要优点。
2mm
2mm
图2 胶板打孔及挖槽示意图
（4）用微量加样器加入10－－20uL的粗提蛋白 和牛血清 ，不要溢出（可加入指示剂） 。 （5）把载玻片放到电泳槽中，倒入巴比妥缓冲液， 琼脂板两端用滤纸与缓冲液搭桥，接通电源，电压 10-12v/cm电泳1-2h。 （6）样品中有蓝色染料，当蓝色接近另一端时，终 止电泳，小心取出载玻片。 （7）用刀片在胶体的中央，划两道平行线。刀刻要 深及底部，两道平行线间隔不可大于3 mm。用大 头针挑去琼脂。 （8）加入人全血清，放入湿盒中，37 ℃下扩散 24h。
实验三 琼脂免ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电泳实验
实验目的
• 了解免疫电泳的原理和用途。 • 掌握免疫电泳的操作过程和方法。 • 掌握免疫电泳实验结果的分析方法，并 对粗提的蛋白进行检测。
实验原理
免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。
先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋 白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的 方向上开槽，加入抗血清。 37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置 与抗体反应形成弧形沉淀线。免疫电泳原理图解 见图。
• PH8.6巴比妥缓冲液配制： • 巴比妥酸 0.92g -----100ml， • 加热熔解 • 巴比妥钠 5.15g-------350ml， • 摇动熔解 • 混合，补足至500ml
双扩试验实验报告
双扩试验实验报告
本质上属于固相免疫沉淀反应;
可溶性抗原和抗体分别在含有电解质的相介质中向四周扩散,若抗体抗原相对应，LI则在比例适宜处形成沉淀线若将待检抗体做系列倍比稀释，可以根据白色沉淀线逐渐消失的情况确定抗体的效价。
试剂与材料
1.已知浓度的抗原:人IgG
2.待测抗血清
3.1.5%琼脂糖:生理盐水配制
4.生理盐水
5.载玻片、移液管、打孔器、针头、移
液器、湿盒
结果判断:
出现沉淀线的最高抗体稀释度即为该抗体在对应抗原浓度下的
效价。
3讨论
本实验制备的抗鸡卵白蛋白血清的目的就是为了让学生0m能够观察到可溶性抗原与相应的抗体在琼脂平板上反应所出现的沉淀线.我们用此方法制备的抗血清效价在14时,就能Vo1 .21No.12004够出现典型的沉淀线.基本上能适用于双扩实验教学另外每只被免疫的兔子分离出的血清基本上能够适用于一-个大班百余名学牛应用.且用
鸡卵白蛋白及其抗体代替AFP及其诊断血清，减少r血液污染的危险
性因此，此实验制备的抗血清既经济又实用:如果此实验方法在免疫
途径的选择上，采用淋巴结或肌肉注射所获得的抗体效价叮能更高些。
免疫学实验教学（复旦大学）实验报告
实验二： 对流免疫电泳实验报告实验者：毛寰宇 时间：2015年3月25日 合作者：周鹏、张国栋一、实验原理对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳分析的结合产物。
CIEP 是一种加速的免疫双扩散技术。
在琼脂糖凝胶平板的两个孔中分别加入抗原和抗体，抗体侧连接电源正极。
通电后，带负电荷的抗原向抗体孔方向移动，而抗体则由于电渗作用被带向抗原孔侧。
两者相遇时形成沉淀物。
可用于检测抗原，但敏感性较低。
在pH8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分（等电点约3~5）常带较强的负电荷，在电场中向正极移动；而作为抗体的IgG ，等电点偏高(约为5~6)，在pH8.6时带负电荷较少，再加上分子量较大，移动速度慢，所以它本身向正极移动缓慢甚至不移动，这样它就会在凝胶的电渗作用下，随水流向负极，电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG 向正极的移动，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线。
二、实验材料1、抗原 & 抗体2、微量可调加样器、加样头、玻片3、打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内）4、电泳液、电泳槽、电泳仪、标签纸5、1.2%琼脂糖(加热溶化）、5ml 刻度吸管、吸耳球三、实验步骤1、制版与打孔：取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml 均匀浇注于玻片上，厚度约1.5~2.0mm 。
待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔。
2、用水倍比稀释抗体：原液、1: 2、1: 4、1: 8。
3、加样：在加样孔中加入5 μl 待测抗原样品（人IgG ）和抗体（羊抗人IgG 血清）。
靠近负极的孔中加入抗原，正极端的孔中加入抗体，玻片标记抗原抗体方向。
4、电泳：将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，以纱布为桥，电压为100v ，时间约30min 。
四、实验结果图1：实验电泳结果A.原液、1:2、1:4稀释抗体条件下均可见沉淀线；1:8稀释度不能见沉淀线。
B.抗体稀释到1:2后，可见沉淀线向抗体侧移动。
1:2和1:4条件下沉淀线位置差异较小。
实验一-双向免疫扩散试验
实验一双向免疫扩散试验一、实验目的1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术二、实验原理在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。
抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。
而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。
因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。
而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。
当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。
如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。
三、实验仪器和试剂1、仪器设备载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器2、试剂和材料（1）生理盐水（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清四、实验步骤1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳—单向双向免疫琼脂扩散
注意事项
加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉
淀线的扩散。
双向免疫琼脂扩散
实验原理
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异 性沉淀线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量 （单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影 响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子 大小及扩散速度相关。
当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。
双向琼脂扩散试验的应用
检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
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操作步骤：
➢ 用定量吸管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑 去孔内琼脂。
➢ 用毛细管将抗原（血清）加入小孔中，将琼脂 板放入pH8.6, 0.05M巴比妥缓冲液的电泳槽中， 样品孔靠近阴极端，两端用四层纱布搭桥，电 泳时电压可调至110V，电泳45~60分钟。
结果讨论
3、根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征， 对其进行定性分析：
若形成完全相连的两条沉淀线，则相邻两孔 抗原成分完全相同；
若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；
若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉 淀线；
结果讨论
4、抗原抗体分子量分析 • 若二者分子质量大致相同，沉淀线为一直
线； • 如抗体分子量较大，沉淀线弯向抗体孔； • 如抗原分子量较大，沉淀线弯向抗原孔；
1:4，1:8，1:16，1:32，1:64等不同滴度。并用微量 移液器分别加10μl于周围孔中。 4. 用微量移液器将抗原加10μl于中央孔。 5. 将玻片置于有盖搪瓷湿盒内，隔天观察结果，绘出沉 淀线位置、数量、形态。
操作示意图
浇板
打孔 加样
温育
结果判断 中央孔—抗体成分 周围孔—不同稀释度的抗原 成分（第1~5孔） 第6孔—阴性对照
注意事项：
• 浇载玻片时，琼脂面要尽量铺平 • 打孔要完整光滑，边缘不要破裂，勿使凝胶底
部与载玻片脱离 • 加样时应一次加满，并防止样品溢出孔外 • 加抗原抗体时，要注意更换加样器吸头 • 扩散时间要适当，时间过短，沉淀线不能出现；
时间过长，沉淀线可能解离或散开而出现假阴 性结果 • 37C扩散后，可在冰箱内放置一定时间，沉淀 线会更清晰，以便观察。
AFP、HBsAg等，但敏感度低，所需时间 长。
免疫电泳实验原理
免疫电泳是将电泳技术与双向琼脂扩散相结 合的一种抗原分析方法。根据抗原中各蛋白质组 分的电荷和分子量大小不同，在电场作用下有不 同的迁移率，从而可将混合物中各种不同组分分 开。实验时，将被检抗原样品先放在琼脂板的小 孔中进行电泳分离，再在其平行方向开槽，加入 已知抗体，进行双向扩散。当相应抗原、抗体比 例合适时，即形成白色沉淀线，根据沉淀线的数 量、位置和形态，即可分析样品中所含的抗原成 分及其性质。
结果讨论
1、根据沉淀线位置估计抗原或抗体的相对含 量
• 沉淀线在两孔中间时，抗原浓度＝抗体浓 度；
• 两者浓度不同时，沉淀线靠近浓度低的孔
结果讨论
2、抗原或抗体的纯度鉴定 • 一对抗原抗体系统只形成一条沉淀线； • 含有若干对抗原抗体系统，则因其含量及
分子大小不同，扩散速度不同，可在琼脂 中形成多条沉淀线。
➢ 从电泳槽中取出琼脂板，用刀片按图在两孔之 间挖一小槽，用针挑去槽内琼脂，在槽内加入 抗抗全血清抗体。
➢ 将载玻片置于搪瓷湿盒内，进行扩散24~48小时 后观察结果。
免疫电泳示意图（1）
免疫电泳示意图（2）
免疫电泳的应用
• 大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析 • 正常和异常体液蛋白的识别等方面
沉淀反应
原理：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。
1. --凝胶内沉淀试验： 以琼脂凝胶为介质进行琼脂扩散的一种实验。抗原 抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 浓度比例适合位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀 环。单向扩散、双向扩散、免疫电泳。
免疫双扩、免疫电泳实验
实验原理
将抗原和抗体分别加到琼脂凝胶板上 的小孔中，使两者相互向对方扩散，经一 定时间后，若两者特异性结合，在琼脂孔 间形成白色沉淀线。
操作步骤
1. 用定量吸管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。 2. 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑去孔内
琼脂。 3. 在100μl Ab1中加入100μl生理盐水，依次稀释成1:2，
Ag
Ab
左：抗原分子量较大；中：抗原抗体分子量大致相同；右：抗体分子量较大
结果讨论
5、抗体效价滴定 • 将固定浓度的抗原加入中间孔，周围孔中
加入系列稀释的抗体，以能出现沉淀线的 抗体最高稀释都作为抗体的效价。
1:64
Ag 1:32
1:16
1:2
1:4 梅花孔可确定Ab效价
1:8
应用
• 可用于血清IgG的检测以外； • 还可用于诊断和分析某些疾病，如检测
免疫学技术
主要内容： 1. 抗原抗体的检测 2. 淋巴细胞的检测
抗原抗体反应的原理及特点
1. 特异性 2. 可逆性 3.
抗原或抗体的检测方法
1. 颗粒性抗原------凝集反应 2. 可溶性抗原------沉淀反应
常规方法： 1. 凝集反应、 2. 沉淀反应、 3. 用标记或抗原进行的抗原抗体反应