对流免疫电泳解析

对流免疫电泳
武汉大学基础医学院 免疫学教研室 熊洁
实验原理
对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的 结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷， 在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加 在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质 都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则 流向阴极，二者方向相反。
终体积(mL) 1.0 1.0
稀释度
1:20 1:40
结果
++++ +++
3
4
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1:80 1:160
++
++
5 0.5 0.5 0.5 1.0 1:320
+
6
7
0.5 0.5
0.5 弃 0
0.5 0.5
1.0 1.0
1:640 盐水对照
-
-
效价—— 能与定量Ag产生明显凝集现象（++）的血清 最高稀释倍数 。
• 电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景 下观察，凡AgAb孔间出现白色沉淀线者为阳性， 孔间无白色沉淀线者为阴性。如沉淀线不清晰可 将琼脂板置37℃温箱数小时后再进行观察，也可 染色观察。
• 在Ag与Ab孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形 状、位置等差异，与Ag、Ab浓度及分子量有关。
相关知识
径3 mm，孔距5 mm。
_
+
_
+
15
37
15
37
26
100 V
48
50 min
26
48
• 加样：用微量加样器取Ag（人血清）20 μL分别 加于阴极侧1、2、3、4孔内，阳极侧5、6、7、8 各孔均加抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜， 但不可溢出孔外。
• 电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸 或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，Ab端 接正极电源。按电场强度4~6 V/cm电泳50 min左 右。
Ab带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗 力，向阴极移动。而Ag所带负电荷多，分子量较 小，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。
如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成 白色沉淀线。由于电场限制了AgAb分子的自由扩 散，因而提高了试验的敏感性(提高10~20倍)，并 缩短了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。同双 扩，可定性确定抗原含量。
2、间接凝集
将可溶性Ag（或Ab）包被在惰性颗粒载体 （红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或 Ag）反应，出现颗粒物凝集的现象。
（二）沉淀反应 定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或
组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下， 免疫比浊 • 琼脂凝胶扩散： ①单向免疫扩散 ②双向免疫扩散 ③对流免疫电泳 ④火箭电泳 ⑤免疫电泳
材料
• 抗原：待测人血清 • 抗体：抗人血清 • 巴比妥缓冲液（0.05 mol/L, Ph 8.6）、1.5%巴比妥
缓冲离子琼脂 • 其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管、
电表
方法
• 制板：取4 ml 煮沸的1. 5％ 巴比妥琼脂，立即浇 注在玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板
• 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔
②试管凝集试验：半定量实验
已知Ag定量测Ab
用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列稀 释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定时 间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度定量 测定血清中的Ab水平及其效价。
试管凝集试验
管号
1
2
盐水(mL) 0.5 0.5
血清(mL) 0.5 0.5
抗原(mL) 0.5 0.5
①单向免疫扩散
[原理]
将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含 Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的 Ag加入孔中。
Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知 的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复合 物所形成的白色沉淀环。
沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同 浓度的标准Ag与固定浓度的Ab抗体反应后测得 沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可 绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从 标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定 抗原或IgG、 IgM、 IgA。
结合 3. 阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段
特异性结合阶段 可见的反应阶段 4. 比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应 现象与两者的分子比例密切相关
抗原-抗体反应受多种因素影响 1 . 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠
作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。
2 . 温度：一般使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。
抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补 体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用 已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知 的抗原检测未知的抗体。
免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技 术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗 体反应的敏感性。
抗原-抗体反应的特点:
1. 特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合 2. 可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键
3. 酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6~8。
（一）凝集反应 定义：是颗粒性Ag（如完整的细菌、细 胞）与相应
Ab，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集物现象。
方法：直接凝集（玻片凝集、试管凝集） 间接凝集
1、直接凝集
①玻片凝集：定性实验，已知Ab测未知Ag
用于细菌和血型鉴定
玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与颗粒 性抗原物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适 当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异 性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如 两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
in the Ab-containing semisolid medium
3. Precipitation Reac
-> The area is proportional to the conc. of Ag.
The region of equivalence
②双向免疫扩散
[原理]
将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小 孔中，使两者各自向四周扩散，若Ag与Ab相对 应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合 处形成白色沉淀线。每一对应Ag和Ab可出现一 条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及 对比关系，可分析Ag或Ab成分。