豚鼠鼻黏膜成纤维细胞的分离、培养及鉴定
第二章 病毒的培养
五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定
细胞 ， 然后用添加有多种细胞因子的内皮细胞基础培养基（ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ ｂ ａ ｓ ａ ｌ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ， Ｅ Ｂ Ｍ一 ２ ） 诱 导培养获 取 Ｅ Ｐ Ｃ ｓ 。
通过形态学观 察 、 Ｃ Ｄ １ ３ ３和 Ｖ Ｅ ＧＦ Ｒ 一 ２抗 体 免 疫 荧 光 染 色 并 结 合 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ － ＵＥ Ａ － １和 Ｄ ｉ ｌ — ａ ｃ — Ｌ ＤＬ 的 摄 取 功 能 来 对 Ｅ Ｐ Ｃ ｓ 进行鉴定分析 ， 同时通过体外管样结构形成能力对 Ｅ Ｐ Ｃ ｓ 进 行功能性 评价。结果 在 Ｅ Ｂ Ｍ一 ２培 养 基 中 诱 导
12实验方法121epcs的分离培养选用约150g的雄性清洁级sd大鼠采用颈椎脱臼法处死浸泡在70的酒精中消毒510min然后将股骨胫骨迅速从大鼠中剥离下来置于已消毒并盛有含双抗的磷酸缓冲液pbs平皿中将股骨胫骨上残留的肌肉剔除干净用手术剪分别剪去股骨胫骨的两端打开骨髓腔用5ml注射器吸取4ml含10胎牛血清fbs的dmem培养基从骨髓腔的一端将骨髓冲出到培养皿中用吸管将平皿中的细胞悬液轻轻吹打混匀然后将悬液贴壁轻轻加入到预置等体积percoll大鼠淋巴细胞分离液1083gml的离心管中悬于上层2500rmin离心30min用吸管小心地将中间云雾状白膜层的单个核细胞吸取到另一离心管中用dmem培养基洗涤两次1000rmin5min弃上清液用含10fbs和多种细胞因子的ebm2培养基重悬细胞以1105个cm2接种于培养板中1d后将未贴壁细胞悬液接种到fn预先包被好的6孔细胞培养板中置于饱和湿度375co2恒温培养箱
培养 ７ ｄ后 ， 出现 类 似 于 血 岛样 的 细 胞 集 落 ， 集 落 中 央 的细 胞 呈 圆 形 ， 周 边 的细 胞 呈 放 射 状 ； ８ ０ 以上 的 细 胞 都 是 Ｃ Ｄ１ ３ ３ ／ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 一 ２ 细 胞 ， 并 且 这 些 细 胞 同 时能 够 摄 取 Ｄｉ ｌ — ａ ｃ — Ｌ Ｄ Ｌ和 结 合 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ － ＵＥ Ａ － １ ； Ｅ Ｐ Ｃ ｓ 在 基 质 胶 表 面 形 成 管 腔 样 结 构 。 结论 密 度 梯 度 离 心法 结 合 差 时 贴 壁 法 从 骨 髓 中 分 离 获 得 的 单 个 核 细 胞 ， 然后经 Ｅ Ｂ Ｍ一 ２条 件 培 养
皮肤成纤维细胞体外培养的安全性实验研究!SafetyAssessmentsfor
·科研论著·皮肤成纤维细胞体外培养的安全性实验研究!中南大学中国医学遗传学国家重点实验室（湖南长沙!"##$%）陈勇陈玉祥龙志高赵迪诚潘乾戴和平夏昆夏家辉【摘要】目的对所建立的人皮肤成纤维细胞系进行安全性检测。
方法对人皮肤成纤维细胞进行形态学观察、染色体核型分析、软琼脂试验、裸鼠致瘤试验、内毒素试验、支原体检测、病毒因子检测、细菌、真菌检测、异常毒性试验。
结果结果均为阴性。
结论所获取的皮肤成纤维细胞可作为一种安全、可靠的靶细胞用于基因治疗研究。
关键词皮肤；成纤维细胞；体外培养；靶细胞；基因治疗［中图分类号］&’()*(+%；,’-’［文献标识码］.［文章编号］"##%-"’$(（(##(）""-""$/-#!!"#$%&’(($(()$*%(#+,-.)"*!/0*102,+23"(%(4.3%.,$50*60%,+!"#$%&’(，!"#$%)*+,-’(，./$012,*(-&，34-50123245467389:329:69;<4=>?3@A4B42>?C，D4B2:3@19E2F GB>H I4:C>26，DF3BJCF3!"##$%，DF>B3【.8C2:3?2】728$9%0:$D9B=E?2C3;4263CC4CCK4B2C9;2F44C238@>CF4=FEK3B CL>B;>8:98@3C2@>B40;$%<+5(.C4:>4C 9;C3;4263CC4CCK4B2C M4:4N4:;9:K4=>B?@E=>BJ?4@@K9:NF9@9J6，?F:9K9C9K4L3:6926N>BJ，C9;2-3J3:24C2，BE=4K>?4?3:?>B9H J4B>?24C2，4B=929O>B24C2，K6?9N@3CK3=424:K>B32>9B，=424?2>9B9;I>:3@3J4B2，83?24:>3，;EBJ>C24:>@424C2C3B=38B9:K3@29O>?>26 24C20=$(.3%(P938B9:K3@?F3BJ4C M4:498C4:I4=04+*93.(0+*QF4;>8:98@3C29823>B4=;:9K CL>B>C3L>B=9;C3;4263B=:4@>H 38@423:J42?4@@;9:J4B42F4:3N60>$&?+,5(!/0*；102,+23"(%；@*:0%,+9.3%.,$；A",B$%$59$33；C$*$%<$,"D&基因治疗（J4B42F4:3N6）是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。
猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002
一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用20021. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3次, 洗至无色, 备用。
将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。
1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。
也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。
室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。
可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。
消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。
1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。
兽医微生物学-革兰氏阳性无芽胞杆菌(李氏杆菌+丹毒杆菌+分枝杆菌)
结核分支杆菌
2. 分离培养：将病料中加入6％ 硫酸或 4％ NaOH溶液处理15min后，经中和、离心， 取少许沉淀物接种在培养基斜面上，每份 病料接4～6管，管口封严，置37℃培养8 周，每周观察一次，培养阳性时，需进行 培养特性和生化特性鉴定。
第一群
产单核细胞李氏杆菌 L.monocytogenes
伊氏李氏杆菌
L.ivanovii
无害李氏杆菌
L.innocua
韦氏李氏杆菌
L.welshimer
塞氏李氏杆菌 L.seeligeri
第二群---格氏李氏杆菌
L.grayi
产单核细胞李氏杆菌，引 致人和动物的李氏杆菌病。
第一群
产单核细胞李氏杆菌 L.monocytogenes
（七）微生物学诊断
1、显微镜检查：取患病动物结节及病变 与非病变交界处组织直接涂片，抗酸 染色后镜检，如发现红色成丛杆菌时， 可做出初步诊断。 结核杆菌，菌体细长，直或微弯。 牛型菌比人型菌粗而短， 禽型菌呈多形性。菌体呈单个散在 排列，少数成对、成丛。
结核杆菌（抗酸染色）
禽分支杆菌
禽分支杆菌
30℃～37℃。 • 4、血平板上生长茂盛，透明，灰白色露滴
状小菌落，α溶血； • 5、明胶穿刺：沿穿刺线横向四周生长，呈
试管刷状，但不液化明胶。
三、生化特性
• 1、糖类发酵：葡、果、乳，＋ • 2、接触酶：－ • 3、IMViC：－－－－ • 4、H2S：＋ • 5、不分解尿素
四、血清型
• 根据肽聚糖抗原可分为：25个血清 型和1a、1b、2a、2b四个亚型。
37℃～37.5℃，在30℃～34℃可生长； 禽分支杆菌可在42℃生长。
2、生长慢，初代分离1-2周才开始生长， 3-4周才能旺盛生长。生长速度：禽型菌 ＞人型菌＞牛型菌。
简述西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养
西 藏 职 业技 术 学院 ８ ５ ０ ０ ３ ０
李小英
摘 要 生物 学是一 门具有众 多知 识 的学科 ，在进行 西藏牦牛胎 儿成纤 维细胞 的培 养 以及 分离过 程 中，可以通过组 织块法 以及 酶消化 法进 行立 体培 养，在 整个培 养过 程 中需要 进行 对 细胞 的原 代 以及 传代培 养，并保 证 在 无菌 的环 境 下进
整为３ ＊ １ ０ ／ ｍｌ ，在２ ４ 孔 的 培 养板 中进 行 按 种 ，每 个孔 放 入 ｌ ｍｌ ，在 间隔 一 天之 后 消 化 收取 三 个 孔 内 的细 胞 ，然 后 记
内脏 、头 、四肢 、尾 巴处 理掉 ，使 用 四抗 盐 水 在此 进 行处 理 ，然 后切 成 ｌ ｍｍ碎块 试 验 。
重 蒸 馏水 器； ３ ｌ ｌ １ 型二 氧 化碳 培 养箱 ； Ｘ Ｄ Ｓ 一 １ Ｂ ｅ Ｎ 置 生物 显 微镜 ；Ｓ Ｗ— Ｃ Ｊ 一 ２ 型超 净 工作 台 ；Ｙ Ｘ２ ８ ０ Ｂ 型医 用高 压蒸 汽 灭 菌锅 。 １ ． ２ 牦牛 胚胎 的 采集 在 西藏 当地 牦 牛 屠 宰 场 取 ３ ０ ｄ 胚龄 左 右 的 西 藏 牦 牛胚 胎 ，使 用放 血 后 ３ ０ ａｉ ｒ ｎ 左右 的牦 牛 子 宫 ，将 内部 子 宫 肌 层
的体 积 比与 细胞 混 合液 混 合在 一起 ，经过 五分 钟 后 ，观 成活 率 。
１ ． ４ 传 代培养
使用 ２ ． ５ ｇ ／ Ｌ 的 胰 蛋 白酶 与０ ． ２ ｇ ／ Ｌ 的Ｅ Ｄ Ｔ Ａ进行 培 养 ， 通过 １ ０ 分 钟 以 内 的浸 泡 ，在 发现 有 大 量纤 维 细 胞 脱 落 之
２ 结果
２ ． １ Ｙ Ｅ Ｆ 的原代 培养
原代细胞分离培养鉴定1(SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞）目录 1 原代分离——SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离2 原代分离——兔关节软骨细胞的分离1、SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离目的与意义体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段，成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。
随着组织工程学的发展，成骨细胞的体外培养已成为骨组织工程体外构建研究的基础。
此外，培养的成骨细胞多取材于动物的骨和骨膜组织。
颅骨人体中：头骨（又名颅骨）：按颅骨所在的部位，B 颅骨分为脑颅和面颅两部分，通常以经过眶上缘和外耳门上缘的连线为分界线。
大鼠：头骨包括颅骨和面骨，颅骨包括：枕骨1块，顶间骨1块，顶骨2块，额骨2块，颞骨2块，基蝶骨1块，前蝶骨1块，筛骨1块。
AC6 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。
成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。
成骨细胞增殖期时其数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。
骨切片HE 染色 成骨细胞短柱状,有突起,核圆形,细胞质强嗜碱性，在将要形成骨组织的地方，排列成单层，彼此由突起相连 D E F分离方法文献方法注意事项1、选择出生24 h内大鼠乳鼠取颅骨, 否则骨组织难以消化；2、取颅骨时应注意剔除骨膜、骨缝中结缔组织及颅顶透明软骨结节, 以减少杂质细胞的污染；3、首次消化液弃去以减少首先消化下来的成纤维细胞、破骨细胞、骨祖细胞等的污染；4、注意消化传代时机, 最好待细胞生长至单层融合时即传代。
传代过早, 细胞数目稀少, 不易生长;传代过晚, 细胞提前分化、衰老, 分泌骨基质；5、传代后可采用差速贴壁法进一步纯化成骨细胞, 因为混杂的成纤维细胞先贴壁, 所以传代后静置 30min, 此时成纤维细胞已经贴壁, 然后轻摇培养瓶, 将仍未贴壁的成骨细胞接种至另一培养瓶；6、适度的消化；7、原代培养容易污染, 应严格无菌操作；参考：刘长剑, 刘建国, 于铁成, et al. Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞[J]. 中国老年学杂志(06):525-527.断头︐取颅骨︵顶骨︶1234 5剥除骨膜，去软骨6 7 剪切，初次消化8 9 二次与后期消化100倍 形态多样，呈三角形、梭形、多角形等不规则形，细胞伸展，有长短不一的突起，呈复层生长。
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养赵进军;胡子有;欧阳晴晴;毋静;陈玉姣;杨敏【摘要】Objective The primary culture of synovial fibroblasts is a convenient tool to study the pathology and physiology of synovialtissues .An improved method was constructed in this study by C57BL /6 mice to study the mechanism of rheumatoid ar-thritis(RA) .Methods The synovium around the hip joints were collected .Attention should be paid to eliminate the "egg-yolk" like yellow oval substance in the middle of the synovium .The synovium was transferred into a 1 .5 mL Eppendorf tube containing 0 .5%type Ⅳ collagenase and cut into 1 mm3 blocks or so .The Eppendorf tube was placed in 37 ℃ Constant temperature orbital shaker incubator for 60 min .After digestion ,the tube was placed on the Vortexfor a high-speed oscillation for 1 .5 minutes to guarantee the separation of cells .Results Within about 1 week ,the first passage was performed by the trypsin digestion method .On day 10 , the number of synovial macrophages reached the maximum and then decreased gradually .After the third generation (day 15 to 20) , the synovial macrophages generally disappeared .Vimentin was suitable for the immunofluorescence cytochemical staining for the synovial fibroblasts .The cell purity was indicated as > 95% .The cytometric analysis indicated that purity of Vimentin and CD90 .2-labelled cells was over 95% ;the purity of CD54-labelled cells was 80% approximately .Conclusion It is a simple and effective method for primary culture of synovial fibroblasts in mice .%目的：利用 C57BL ／6小鼠探索出一种改良的小鼠滑膜成纤维细胞（SF）的原代培养方法，以方便类风湿关节炎（RA）关于滑膜炎的研究。
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《中国组织工程研究》Chinese Journal of Tissue Engineering Research 文章编号:2095-4344(2019)15-02369-04 2369 www.CRTER.org ·研究原著·
庄翔莉，女，1991年生，福建省泉州市人，汉族，福建中医药大学在读博士，主要从事小儿变态反应性疾病研究。
通讯作者：郑健，教授，主任医师，博士生导师，福建中医药大学，福建省福州市 350122；福建中医药大学附属人民医院，福建省福州市 350004
文献标识码:B 稿件接受：2018-12-23
Zhuang Xiangli, Doctoral candidate, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Corresponding author: Zheng Jian, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China ; People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, Fujian Province, China
豚鼠鼻黏膜成纤维细胞的分离、培养及鉴定 庄翔莉1，吴 博2，陈莹莹3，甘思雨4，林 青5，郑 健1，5 (1福建中医药大学，福建省福州市 350122；2福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003；3泉州市中医院，福建省泉州市 362000；4福建中医药大学附属第三人民医院，福建省福州市 350108；5福建中医药大学附属人民医院，福建省福州市 350004)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1163 ORCID: 0000-0003-3919-3762(庄翔莉)
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文题释义： 变态反应性鼻炎：又称变应性鼻炎，是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的介质(主要是组胺)释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病，以鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻黏膜肿胀等为主要特点。 豚鼠：荷兰猪又名天竺鼠、葵鼠、豚鼠、几内亚猪，在动物学的分类是哺乳纲啮齿目豚鼠科豚鼠属。尽管名字叫“几内亚猪”，但是这种动物既不是猪，也并非来自几内亚。它们的祖先来自南美洲的安第斯山脉，根据生物化学和杂交分析，豚鼠是一种天竺鼠诸如白臀豚鼠(C. aperea)、艳豚鼠(C. fulgida)或草原豚鼠(C. tschudii)等近缘物种经过驯化的后代。豚鼠是珍贵的皮肉兼用的多用途草食动物。荷兰猪成年体质量1.0-1.5 kg，体长20-30 cm，皮毛紧披，富有光泽，种属分布共5属15种，为南美洲特产。
摘要 背景：鼻黏膜成纤维细胞可通过分泌多种细胞因子和趋化因子，参与多种鼻部疾病的炎症反应和损伤修复；豚鼠是最适合用于变态反应性疾病研究的实验动物之一。 目的：探讨豚鼠鼻黏膜成纤维细胞分离、培养、纯化和鉴定的有效方法。 方法：胶原酶消化法分离豚鼠鼻黏膜成纤维细胞，经差速贴壁法纯化后，采用倒置相差显微镜进行形态学观察，波形蛋白免疫细胞化学法鉴定成纤维细胞，并通过MTT检测法绘制细胞生长曲线。 结果与结论：①倒置相差显微镜下可见原代鼻黏膜成纤维细胞中有不同形态细胞交杂生长，以类梭形和扁平状细胞为主，细胞成团散落分布；纯化后的成纤维细胞形态均一，多呈长梭形，分布较均匀，呈鱼群状或放射状排列；②免疫细胞化学染色显示，成纤维细胞波形蛋白表达呈阳性；③细胞生长曲线大致呈“S”形。④结果表明，所分离培养的细胞具有典型的成纤维细胞生物学特征。 关键词： 成纤维细胞；豚鼠；鼻黏膜成纤维细胞；原代细胞培养；鼻黏膜；波形蛋白；成纤维细胞波形蛋白 主题词： 成纤维细胞；豚鼠；组织工程 中图分类号：R446；R318 基金资助： 国家自然科学基金(81373820)，项目负责人：郑健
豚鼠鼻黏膜成纤维细胞分离、培养、纯化和鉴定 方法： (1)以胶原酶消化法分 离豚鼠鼻黏膜成纤维细胞； (2)经差速贴壁法纯化。
检测： (1)成纤维细胞形态观察； (2)波形蛋白免疫细胞化学 鉴定成纤维细胞； (3)细胞生长曲线。
结论： 所分离培养的细胞具有典型的成纤维细胞生物学特征。 庄翔莉，吴博，陈莹莹，甘思雨，林青，郑健. 豚鼠鼻黏膜成纤维细胞的分离、培养及鉴定[J].
中国组织工程研究，2019，23(15):2369-2372. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1163
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2370
Isolation, culture and identification of guinea pig nasal mucosa fibroblasts Zhuang Xiangli1, Wu Bo2, Chen Yingying3, Gan Siyu4, Lin Qing5, Zheng Jian1, 5 (1Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 2Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 3Quanzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Quanzhou 362000, Fujian Province, China; 4Third People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian Province, China; 5People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, Fujian Province, China)
Abstract BACKGROUND: Nasal mucosa fibroblasts are reported to involve in inflammation and wound repair of various nasal diseases by secreting a variety of cytokines and chemokines. Guinea pig is a most suitable experimental animal for the study of allergic diseases. OBJECTIVE: To investigate the effective methods of isolation, culture, purification and identification of guinea pig nasal mucosa fibroblasts. METHODS: Guinea pig nasal mucosa fibroblasts were isolated by collagenase digestion, and purified by differential velocity adherence. The morphology of fibroblasts was observed by inverted phase contrast microscope, fibroblasts were identified by vimentin immunocytochemical staining, and the cell growth was detected by MTT assay to draw the growth curve. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under inverted phase contrast microscope, there were cells with different shapes in the primary nasal mucosa fibroblasts, most of which showed spindle-like and applanate shape, and cells were scattered distribution in cluster. The purified fibroblasts were homogeneous, mainly were long spindle-shaped, and distributed in fish shoal-like and radial-like. (2) Immunocytochemical staining indicated that fibroblasts were positive for vimentin. (3) The cell growth curve appeared to be typical S-shaped. (4) To conclude, the isolated and cultured cells exhibit typical biological characteristics of fibroblasts. Subject headings: Fibroblasts; Guinea Pigs; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81373820 (to ZJ)
0 引言 Introduction 变应性鼻炎是指特异性个体接触变应原后由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病，是临床最为常见的变态反应性疾病之一[1]。变应性鼻炎的发病机制较为复杂，涉及大量的细胞因子和炎症递质，是多因素、多环节共同作用的结果。近年研究表明，鼻黏膜成纤维细胞可通过分泌多种细胞因子和趋化因子，参与多种鼻部疾病的炎症反应和损伤修复[2-5]。因此，实验旨在探索一种豚鼠鼻黏膜成纤维细胞分离、培养、纯化和鉴定的有效方法，为进一步从细胞分子水平研究变应性鼻炎的发生机制和防治方法提供新方法和新思路。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞培养实验观察。 1.2 时间及地点 实验于2016年1月至3月在福建中医药大学中西医结合研究院医学实验中心完成。 1.3 材料 1.3.1 实验动物 健康清洁级豚鼠10只，雌雄各半，体质量200 g左右，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0011。实验过程中根据中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》处置实验动物。 1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12不完全培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)；澳洲胎牛血清(美国Gbico公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，美国HyClone公司)；Ⅰ型胶原酶(美国SIGMA公司)；MTT(美国Solarbio公司)；波形蛋白抗体(Anti-Vimentin antibody)(美国Abcam公司)；SABC免疫组化染色试剂和DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；恒温水浴摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)；全自动酶标仪(瑞士TECAN公司)。 1.4 实验方法 1.4.1 原代鼻黏膜成纤维细胞的分离和培养 正常健康豚鼠予麻醉致死后，在无菌条件下剥离鼻中隔两侧鼻黏膜，经含500 U/mL 双抗的PBS溶液反复洗涤3-5次，以眼科剪剪碎黏膜块(≤1 mm3)后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，在37 ℃恒温水浴摇床中消化，每隔2 h收集一次上清液，并更换新的胶原酶再次进行消化，重复收集4次。每次收集的上清液经200目细胞筛过滤后，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，以含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养液重悬细胞，接种于25 cm2培养瓶中(原代)，置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中进行培养，24 h后进行第1次细胞换液，以除去悬浮杂质及细胞碎片，待细胞生长至接近完全融合成单层细胞时，进行传代培养(F1代)。 1.4.2 差速贴壁法纯化成纤维细胞 根据上皮细胞与成纤维细胞贴壁时效不同的特点，在细胞传代时将单细胞悬液接种于新培养瓶内，置于细胞培养箱中培养15-20 min后，镜下观察贴壁细胞，并轻柔倾倒培养液，去除尚未贴壁的混杂细胞，重新加入含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液进行培养。重复纯化直至F3代细胞时，进行细胞鉴定。 1.4.3 成纤维细胞的鉴定 形态学观察：倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长