常用的半抗原与蛋白偶联方法简介修订稿

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8- 常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到。 6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到。 7、用PBS透析2天 8、-20度保存（浓度为20mg/mL）

双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。 应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤 1、用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液) 2、取与β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L (B液) 3、将A液倒入B液。 4、20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇 10 m mol/L、的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。 5、过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。

（三）含巯基半抗原的偶联 可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

（四）含羟基的半抗原偶联 醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤 1、15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。 2、加热回流1小时。 3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。 4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到）. 5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度） 6、取 半琥珀酸酯溶于 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。 7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。 8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。 9、65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。 10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。 半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤 1、20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。 2、加1滴乙二醇(得A液) 3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至）中 4、4度反应2小时，期间不断调节 5、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。 4度反应过夜。 6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液透析(更换透析液数次)

（五）含酮基或酮基半抗原的偶联 是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺 酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤 1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺 （O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L 2、加热回流90分钟 3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提 4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。

（六）、其他半抗原的偶联 虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白 偶联。 制备雌二醇-6-肟的操作步骤 a、雌二醇二醋酸盐的制备 1、1g雌二醇溶于14ml 吡啶及 醋酐中 2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。 3、收集白色晶体，得产物约（熔点126到127度） b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备 4、雌二醇二醋酸盐，滴加冰醋酸 溶解后加含 CrO3的含水冰醋酸 (H2O:Hac=: 5、室温搅拌1小时，静置24小时 6、用水稀释，用乙醚提取4次 7、用蒸馏水洗2次 8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。 9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg 10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加 冰醋酸及吉纳你特T试剂(Girad T)，回流1小时。 11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用LNaOH调节pH至 12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。 13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L). 14、室温静置2小时。 15、用乙醚抽提3次。 16、合并乙醚抽提液，用L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。 17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。 18、加7ml 醋酐，回流20分钟。 19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度) c、二醇-6-酮的制备 20、用 20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。 21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。 22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度) d、雌二醇-6-肟的制备 23、取雌二醇-6-酮 50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml中，回流小时。 24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml 25、用2 mol/L NaOH调节pH至。 26、用醋酸乙酯抽提4次 27、水层用1 mol/L盐酸酸化至。 28、用醋酸乙酯抽提4次 29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)

其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。