基因工程重点整理

基因工程重点

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基因工程：Gene Engineering 质粒：Plasmid

核糖体结合位点：RBS 碱基对：base pair，bp

连接酶：ligase

碱性磷酸酶：alkaline phosphatase，

多克隆位点：multiple cloning site，MCS

cDNA末端的快速扩增：rapid amplification of cDNA end，RACE 抑制性扣除杂交：suppression subtractive hybridization，SSH 开放读码框：open reading frame，ORF

第一章基因工程概述

1953年，Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型。

DNA的结构与功能（P5）：

1、DNA的结构

组成成分：3种成分（五碳糖、磷酸集团、含氮碱基）。等量关系：A=T、C=G

其中含氮碱基包括：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）。

三维结构：双链缠绕的反向平行双螺旋结构，碱基通过氢键配对。

脱氧核糖和磷酸集团形成链状结构，碱基在双链内部相互配对排列。

2、DNA的复制：半保留复制，任何一条链都是另一条链的镜像互补。

3、遗传信息的传递：一个基因一个酶，一个基因一个蛋白质。

RNA的桥梁作用（RNA是DNA遗传信息和蛋白质氨基酸序列之间的信息桥梁）。

4、指导蛋白质合成

3种RNA，密码子，反密码子，翻译，调节蛋白，抑制蛋白质，激活蛋白质，正调控，负调控，操纵子

DNA可以编码三种RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子互补，并在蛋白质合成过程中将AA携带到正确的位置。

转录：以DNA为模板将遗传信息转移到mRNA的过程。

翻译：将mRNA中的遗传信息转移到蛋白质的AA序列的过程。

调节蛋白指导基因表达的控制。

负调控：调节蛋白结合到调节位点并抑制转录。

正调控：激活蛋白通过引发DNA解开螺旋并刺激转录的发生。

基因工程的工具（P7）

基因操作的车间——大肠杆菌和病毒

获得基因片段的工具——限制性内切核酸酶

连接基因片段的工具——连接酶

基因操作的载体——质粒和病毒

基因（P9）：是遗传信息的基本单位，是染色体组核酸分子，是作为遗传物质的核酸分子上的一个片段；可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外。

基因的结构特点（P10）：①基因及其产物的共线性；②基因及其产物的非共线性；③基因的重叠性与基因的可变性④有启动子和终止子

启动子（P11）：是基因转录过程中控制起始的部位，转录起始是一个基因是否表达的关键

一步。上游指的是转录起始点左侧的序列，下游指起始点右侧的序列（上游指5’方向，下游指3’方向）

终止密码子：3个，UAA、UAG、UGA

起始密码子：2个，AUG（甲硫氨酸）、GUG（缬氨酸）

转录终止子：一种依赖因子，另一种不依赖因子，后者能形成特定二级结构的DNA序列。

基因工程的步骤（P12，图1-4，提取、切接连转筛）：

第二章分子克隆工具酶限制性内切酶的命名法则，常见三种酶的酶切位点

限制性内切酶的命名法则（P16）

命名时，第一个字母（大写、斜体），代表属名，第二、三个字母（小写，斜体）是种名头，第四个是菌株号，然后再加上罗马字序号（发现顺序）。前面3个字母是斜体，后面的都为正体。

如Hin dⅢ限制性内切酶，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来自菌株Rd，Ⅲ表示序号。

限制酶识别的序列（P18）：

识别位点出现的频率：4n

限制酶识别的序列大多数为回文结构，即镜像对称结构。

Eco RⅠ、Hin dⅢ、Bam HⅠ的识别序列和切割位置如下：

同裂酶（P19）：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

同尾酶（P22）：这种酶切割DNA产生的末端是相同，而且是对称的，即它们可以产生相同的黏性突出末端。

位点偏爱（P24）：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称为位点偏爱。

应对位点偏爱的方法：超量用酶，延长切割时间。

终止酶切的方法（P26）：

添加EDTA（乙二胺四乙酸）、加热法、纯化法（苯酚抽屉去蛋白或用试剂盒纯化DNA）

星星活性（P26）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性（星星活性降低酶切反应的特异性）。

星星活性产生的原因：

①反应体系中甘油浓度高（>5%）

②酶过量（>100U/）

③离子强度低（<25mmol/L）

④高pH值⑤含有机溶剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等

⑥非Mg2+离子的二价离子存在，如Cu2+、Zn2+等

抑制星星活性的措施：

①减少甘油浓度

②减少酶的用量

③提高离子强度到100～150mmol/L）④降低反应pH值到7.0

⑤保证反应体系中有无机溶剂或乙醇

⑥保证使用Mg2+为二价阳离子

DNA聚合酶（7大类），书中提到的例子有：

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、反转录酶、末端转移酶

KlenowDNA聚合酶（P31）：具有3’→5’的外切核酸酶活性。

作用：补平DNA的3’凹端、抹平DNA的3’凸端、通过置换反应对DNA进行末端标记、随机引物标记等。 TaqDNA聚合酶（P32）：在高温下具有活性的DNA聚合酶，最佳活性温度为72。