河南省甘薯脱毒技术研究现状及展望

1 甘薯病毒病发生情况调查
1998- 2002 年, 在甘薯的不同生育期对杞县、 汝州、洛阳、郑州、许昌、禹州、南阳等地的 13 个甘薯 品种进行调查, 发现河南省甘薯病毒病发生非常普 遍, 品种感病率和田块发病率均为 100% , 田间病株 率为 60% ~ 90% 。虽然不同品种间发病率有差异, 但没有发现抗病品种[ 3] ; 甘薯地上部病毒症状主要 有叶斑、花叶、卷叶、叶片皱缩和叶片黄化等类型, 以 叶斑类型为主, 如紫色羽状斑、紫斑、黄斑等。薯块
3 甘薯病毒的检测技术研究
目前常用的病毒检测方法有目测法、指示植物 法、血 清 学 检 测 方 法 和 分 子 生 物 学 检 测 方 法 等[ 18, 19] 。以酶联免疫吸附法( EL ISA ) 为基础的血 清学检测方法和基于核酸的 P CR 和杂交检测技术 具有快速、特异、检测样品量大等特点, 是目前研究
在全省 10 个县 21 个点( 次) 进行的小区对比 试验结果表明[ 5] , 脱毒甘薯的增产效果非常明显, 增 产幅度为 17. 9 % ~ 176. 0 % , 平均 61. 8 % 。不 同品种间的增产幅度存在较大差异, 一般每公顷增 产鲜薯 2 593. 5~ 53 062. 5kg , 平均 14 703kg 。脱毒 甘薯在较大面积示范中也表现了良好的增产效果。 1998 年, 唐河县城郊乡权庄村种植 0. 2hm 2 脱毒甘 薯, 折产 60 378kg/ hm2, 比非脱毒甘薯增产 108% 。 社旗县1. 67hm2脱毒春薯, 产量平均达 50490kg/ hm2, 比未脱毒甘薯增产 70. 9% ; 5. 13hm2 夏薯平均产量 35175kg/ hm2, 比未脱毒甘薯增产 39. 6% 。1999 年, 南阳 卧 龙 区 种 植 40hm2 脱 毒 甘 薯, 产 量 平 均 达 30000kg/ hm2, 而未脱毒甘薯只有 20640kg/ hm2, 增 产 45. 3% 。
1979 年, 台湾学者在台农 65 号甘薯品种上首 次发现 SPL V [ 12, 13] 。该病毒侵染甘薯一般不产生明 显的叶部症状, 有的仅产生轻度斑驳。李汝刚等[ 14] 利用国际马铃薯中心制备的 SP LV 的抗体, 对采自
收稿日期: 2009- 06- 11 作者简介: 张振臣( 1964-) , 男 , 河南延津人, 研究员, 博士, 主要从事植物病毒研究。
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2009 年第 9 期
1997 年以来, 河南省农科院等单位利用茎尖培 养结合热处理等技术, 培养成功了豫薯 7 号、豫薯 12 号、豫薯 13 号、商薯 19、汝薯黄、徐薯 18、梅营 1 号、北 京 553、徐薯 34、郑红 11、苏薯 8 号、安平 1 号、济薯 18 等脱毒甘薯品种, 其中脱毒豫薯 7 号、12 号、13 号、汝 薯黄、梅营 1 号、郑红 11、苏薯 8 号、安平 1 号等品种 为首次培养成功并大面积推广应用[ 5] 。
SP V MV 是 P oty vi r us 属一个 新的暂定种[ 16] , SPVMV 也 称甘 薯 病毒 2 ( Sw eet p otat o vi rus 2, SPV2) 和 甘 薯 病 毒 Y ( Sw eet p otato vi rus Y, SPV Y ) 。上世纪 80 年代, R ossel 等[ 17] 首先从台湾 和尼日利亚甘薯上分离到该病毒。SPVY 病毒粒体 丝状, 长 850nm , 侵染细胞产生风轮状、卷轴状内含 物和由非结构蛋白构成的晶状物, 侵染寄主产生明 脉、花叶、畸形、褪绿等症状。靠桃蚜( M yzus pers-i cae) 以非持久方式传播, 也可机械传播。但以机械 传播方式系统侵染甘薯时, 必须先在甘薯上预先接 甘薯褪绿矮缩病毒( Sw eet po tat o chlo rot ic st unt v-i r us , SPCSV ) 。寄 主 范 围 与 SPL V 相 似。At eka 等[ 16] 克隆了 12 个来自中国、葡萄牙、南非和赞比亚 的 SPVM V 分离物 的 CP 基 因及 3'端非 编码区 序 列, 这 12 个分离物的核苷酸序列一致性在 81% ~ 99% , 氨基酸序列一致性在 86% ~ 99% 。
的重点。 在甘薯病毒快速检测技术研究方面, 河南省农
科院初步建立了几种甘薯主要病毒的检测技术。张 振臣[ 20] 、付振艳[ 11] 、黄玉娜[ 15] 等分别在大肠杆菌中 高效表达了 SPF MV、SP VG、SP LV 和 SPVM V 的 CP 基因, 通过纯化蛋白, 免疫家兔制备了上述病毒 的特异性抗血清, 并通过优化反应条件, 初步建立了 上述 4 种病毒的 EL ISA 检测技术。
上的症状以黑褐色或黄褐色龟裂纹为主[ 3~ 5] 。
2 甘薯病毒种类的分子鉴定
2. 1 甘薯 G 病毒 ( SPVG) 目前, SPVG 仅 在 中 国、埃 及 和 美 国 有 过 报
道[ 6 ~ 8] 。Co linet[ 9] 等利 用中 国广东 的甘 薯病 毒材 料, 克隆了 SPVG 广东 分离物( SPVG- CH ) 的外壳 蛋白( CP) 基因, 发现 SP VG- CH 的 CP 基因由 1 065 个核苷酸组成, 编码 355 个氨基酸残基, 是已知 Pot yvirus 病毒中外壳蛋白最大的一个。Colinet 等[ 10] 此后又鉴定到一个分离物 SPVG- CH 2, SPV G- CH 2 与 SPVG- CH CP 基因 的核苷 酸序 列一 致性 仅为 85. 4% , 氨基酸序列一致性为 93. 5% , 说明 SPVG 不同分离物之间存在较大的差异。付振艳[ 11] 等利 用 RT- PCR 方法克隆了 SPVG 河南分离物( SPV GH N) 的 CP 基因, 序列分析 表明, SPVG- H N CP 基 因 由 1 065 个 核 苷 酸 组 成 ( GenBank 登 录 号 为 DQ399861) , 编码 355 个氨基 酸残基, 与 GenBank 中 Eg ypt 1( AJ515380) 、L SU- 1( AY178991) 和 L SU3( AY178990) 分离物的核苷酸 序列一致性为 98% 左右, 与 中 国 广东 分 离 物 SPV G- CH ( X76944) 和 SPVG- CH 2( Z83314) 的核苷酸序 列一致性 分别为 98. 1% 和 85. 5% 。说 明 SPVG- H N 与 SP VG- CH 属同一类型, 而与 SP VG- CH 2 关系较远。 2. 2 甘薯潜隐病毒( SP LV)
在甘薯病毒的多重 PCR 和核酸杂交检测技术 研究方面, 设计了 SPL V、SP VG 和 SP FM V 3 种病 毒的特异性引物, 通过优化反应条件, 建立了可同时 检测上述 3 种病毒的多重 RT- PCR 检测技术, 即在 一次 PCR 反应中同时检测上述 3 种病毒, 有效地提 高了检测效率, 降低了生产成本。另外, 以非放射性 物质地高辛( DIG) 为标 记物, 制备 了 SP L V 的 cDNA 探针, 建立了可 有效区分 SP GV 和 SP FM V 的 核酸斑点杂交检测技术, 为 SPL V 的特异性检测提 供了一种简便、有效和安全的方法。 甘薯潜隐病毒 ( SP LV) 特异性探针 制备及快速检 测方法( 专利申 请号: 200810049089. 5) 和 三种甘 薯病毒的 多重 RT- PCR 检测方法( 专利申请号: 200810049503. 2) 申报了国家发明专利。
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河南农业科学
北京、江苏、四川和山东的 200 份甘薯样品进行了血 清学检测, 发 现上述 4 个省 ( 市) 甘薯上 普遍存 在 SPL V 。Colinet 等[ 13] 测 定 了 SPL V 台 湾 分 离 物 ( SPL V- T ) 和广东分离物( SPL V- CH ) 的 CP 基因, 发现 SP LV- CH CP 的 N 末端存在 P ot y vi rus 属病 毒蚜传所必需的 DAG 基序, 而 SPL V- T 的 CP 相应 位置则突变为 DT G, SP LV- T 和 SPL V- CH CP 基 因的核苷酸序列一致性为 93. 5% , 认为 SPL V- T 和 SPL V- CH 为 SPL V 的 2 个不同株系。黄玉娜[ 15] 等 利用 RT- P CR 方 法 克 隆 了 SPL V 河 南 分 离 物 ( SPVL- H N) 的 CP 基因及部分 3' 端非编码区序列, 序列分析表明, SPL V- H N CP 基因由 879 个核苷酸 组成( GenBank 登录号为 DQ399862) , 编码 293 个 氨基酸残基, 与 SP LV- CH 和 SPL V- T 分离物的核 苷酸序列一致性分别为 96. 8% 和 93. 0% , 与日本 分离 物 的 核 苷 酸 序 列 一 致性 为 83. 6% 。而 且, SPL V- H N 与 SPL V- CH 以及日本分离物一 样, CP 的 N 端存在 Poty v ir us 属病毒蚜传所特有的 DA G 基序。说 明河 南 分 离物 与 广东 分 离 物应 属 同 一 类型。 2. 3 甘薯脉花叶病毒( SP VMV)
5 脱毒甘薯的示范推广及增产效果
河南省农科院等单位制定了河南省甘薯脱毒及 繁育技术操作规程, 起草了脱毒甘薯的质量标准, 规 范了脱毒甘薯的生产场地、过程和病毒检测方法等。 在河南省初步建立了以河南省农科院为龙头, 由多 个市县参加的脱毒甘薯原原种、原种以及良种三级 繁育和供种体系, 使脱毒甘薯在河南省获得了较大 面积的应用。河南省从 1997 年开始示范推广脱毒甘 薯, 当年示范推广 0. 07 万 hm2, 1998 年 0. 67 万 hm2, 1999 年发展到 5. 3 万 hm2, 10 年来已累计示范推广 近 66. 7 万 hm2 。
4 脱毒技术研究及脱毒新品种的培养
河南省农科院对甘薯茎尖成苗培养及快繁培养 的培养基进行了研究, 筛选出了适合不同甘薯品种 的茎尖成苗和快繁培养基。在光照及激素对茎尖成 苗的影响研究方面, 黄冰艳等[ 21] 根据不同基因型甘 薯茎尖分生组织在不同激素水平的生长反应, 将 4 个河南主栽甘薯品种分为 3 类: 激素不敏感易成苗 型、激素敏感易成苗型和激素不敏感难成苗型, 并针 对每种类型提出了相应的调整培养基和激素水平、 改变光照时数和培养温度等具体措施, 使茎尖培养 成苗率达到 75% 以上; 黄冰艳等[ 22] 以 M S 培养基为 基础, 探讨了培养基中的有机营养成分( 除蔗糖外) 及光照在试管苗快繁中的作用。结果表明, 缺乏有 机营养成分( 除蔗糖外) 对试管苗生长无显著影响。 光照不仅影响试管苗的器官建成, 也影响试管苗的 生长, 光照时数以不低于 16h/ d 为宜。另外, 在简 化快繁培养基、降低培养成本方面, 研究了使用不含 有机物的 1/ 2M S 培养基和用食用白糖代替蔗糖、用 卡拉胶代替琼脂、用自来水代替蒸馏水、试管苗单叶 节或双叶节扦插快繁等多项简化措施, 使离体快繁 成本降低了近 80% 。