生物化学-实验一吸光光度法-
生化实验
实验一基本技术操作及吸光光度法*********************************************实验须知一、实验目的1、通过实验验证生化的基本理论，巩固所学知识。
2、掌握生物化学及分子生物学基本实验方法。
3、培养严谨、认真、实事求是的态度和正确的思维方法。
二、实验要求1、课前预习，课中认真做笔记。
2、按照实验室要求规范操作，如实记录实验结果。
3、认真，按时（当堂）完成实验报告。
三、试剂使用1、核对标签，切勿拿错试剂。
2、刻度吸管或移液器头（Tip头）与试剂必需一一对应，以免引起试剂的交叉污染。
3、用后盖好瓶盖，归还原处。
切勿张冠李戴。
四、仪器使用1、爱护仪器设备，严格遵守操作规则，注意安全。
2、精密仪器，未经允许，不得动用。
3、仪器出现故障，应立即关闭电源，报告老师。
五、实验室规则1、穿工作服进入实验室，遵守课堂纪律。
2、节约水、电、试剂，实验完毕后，清洗所用器材。
3、注意安全，若发生酸碱灼伤，应立即用大量清水冲洗。
4、值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水电、门窗，收齐实验报告。
基本技术操作一：玻璃仪器的洗涤及干燥：（一）意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。
（二）常用洗涤剂：1．洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉----用于一般去污。
2．强酸，强碱，尿素------去除蛋白质，核酸。
3．铬酸洗液------见附2。
4．水（自来水，蒸馏水）------用来冲洗容器。
（三）洗涤方法：* 洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱1．新仪器的洗涤：2%的盐酸浸泡数小时→自来水冲净→洗涤剂溶液中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。
2．非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等）用后立即放入洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→检查是否洗净→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。
生物化学实验
3、显色剂50～100mL
1.1％水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2.取层析滤纸(长22cm、宽14 cm)一张。在纸的—端距边缘2～3cm处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。
5.显色用喷雾器均匀喷上O.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6.计算各种氨基酸的只Rf值。
思考题
1、何谓纸层析法?
2、何谓片Rf值?影响Rf值的主要因素是什么?
3、怎样制备扩展剂?
4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较
实验一纸层析法分离鉴定氨基酸
一、目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：
…
在一定的条件下某种物质的只Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。
本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。
三、器材
1.25mL刻度试管 2. 吸管
3.离心管 4.乳钵
5.分光光度计 6.恒温水浴
7.离心机
四、试剂和材料
1、小麦种子
2、o.1％标准麦芽糖溶液
00 生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-比色分析技术
比色分析技术分光光度法是利用单色器（主要是棱镜）获得单色光来测定物质对光吸收能力的方法。
物质对不同波长的光波具有选择吸收的特性，分光光度法就是基于物质的这种特性而建立起来的分析方法，它是光谱分析技术中最基本和最常用的方法，因其具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。
一、比色分析的基本原理比色分析技术是利用物质对光的吸收作用来对物质进行定性或定量分析的技术。
分光光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外 - 可见光分光光度法。
（一）吸光度与透光度当一束光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I 0 ，透射光强度为I ，I 和I 0 的比值称为透光度（ transmittance ，T ），即T ＝，其数值小于 1 。
T 与 100 的乘积称为百分透光度，以 %T 表示。
透光度的负对数称为吸光度 (absorbance ， A) 。
其表达式为：A ＝－LgT ＝－Lg ＝Lg（二） Lambert-Beer 定律Lambert-Beer 定律指出当一束单色的辐射能通过介质或溶液后，有一部分被吸收，其辐射能的吸收与溶液中吸收物质的浓度和溶液厚度的乘积成正比。
Lambert-Beer 定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
Lambert-Beer 定律是描述溶液吸光度同溶液浓度和溶液液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：A ＝KLC式中，A ——吸光度；K ——吸光系数；L ——溶液厚度，称为光径；C ——溶液浓度。
根据 Lambert-Beer 定律，当液层厚度单位为 cm ，浓度单位为 mol/L 时，吸光系数K 称为摩尔吸光系数（ε）。
ε的意义是：当液层厚度为 l cm ，物质浓度为 l mol/L 时，在特定波长下的吸光度值。
ε是物质的特征性常数。
在一定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。
项目五——吸光光度法
03
吸光光度法的仪器和试剂
分光光度计
01
定义
分光光度计是分光光度法中使用的核心仪器，用于测量溶液对特定波长
的光的吸光度。
02 03
工作原理
分光光度计通过光源发出连续光谱的光，经过单色器分光后，得到特定 波长的单色光，照射到样品上，然后通过检测器检测透过样品的光强， 从而计算出样品的吸光度。
类型
常见的分光光度计有紫外-可见分光光度计、红外分光光度计等。
酶活性测定
某些酶催化的反应会产生或消耗具有 特定吸光特性的物质，利用吸光光度 法可以测定这些物质的浓度变化，从 而推算出酶的活性。
工业生产中的吸光光度法
产品质量控制
在某些工业生产过程中，产品的吸光特性与其质量密切相关。通过吸光光度法测 量产品的吸光度，可以实时监控产品质量，确保生产过程的稳定性和产品的一致 性。
通过合成具有更高选择性和灵敏度的试剂和探针，提高吸光光度法 对目标分析物的检测灵敏度。
引入多元校正技术
利用多元校正算法，消除干扰因素，提高吸光光度法在复杂样品中 的测量精度和灵敏度。
拓展应用领域和范围
环境监测领域
将吸光光度法应用于大气、水体 等环境样品的检测，实现对环境
污染物的快速、准确测定。
生物医学领域
引入人工智能、物联网等技术， 实现吸光光度法仪器的远程操控 、数据自动处理和分析等功能， 提高仪器的易用性和分析效率。
多功能集成
将多种分析方法集成到一台仪器 中，实现一台仪器同时具备多种 分析功能，提高仪器的综合性能
和应用范围。
谢谢您的聆听
THANKS
常见试剂
常见的吸光光度法试剂有显色剂、还原剂、氧化剂等。
使用注意事项
实验一、比色分析法和分光光法
（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法
（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量
仪器试剂
一、器材 [1] 试管及试管架 [2] 移液管(5、1、0.5ml、 0.2ml) [3] 可见分光光度计
二、试剂（在实验手册中，有配制方法） [1] 标准BSA溶液 [2] Fo1in—酚试剂 [3] 碱性铜液（现用现配制），且注意配制时，要先混合B液再加A液。 [4] 0.9% NAcl
基本原理
一.光由几部分组成：3部分
二、物质对光的选择性吸收
1、光的互补性与物质的颜色
单色光：只具有一种波长的光。
混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。
可见光分为哪几个单色光？
黄 橙 红
绿
青
白光
青蓝
紫
蓝
物质的颜色是由于物质对不同波 长的光具有选择性的吸收作用而 产生的，物质的颜色由透过光的 波长决定。
例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝色； 高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。 如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以
得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜色和 吸收的光颜色之间是互补关系。
/nm
颜色
互补光
400450
紫
蓝
黄绿
黄
黄 橙 红
绿
青
450480
480490
绿蓝
蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
内容
1
2 3 3 4
比色分析法和分光光度法 比色分析的测定方法 分光光度计的基本结构与使用 蛋白质的含量测定
比色分析法
概念：用比较溶液颜色深浅来确定溶液中有色 物质含量的方法
生物化学的实验技术有哪些
生物化学的实验技术有哪些生物化学是一门研究生物体化学组成和生命过程中化学变化的学科，实验技术在生物化学的研究中起着至关重要的作用。
以下为您介绍一些常见的生物化学实验技术。
一、分光光度法分光光度法是一种基于物质对光的吸收特性来定量分析物质浓度的方法。
在生物化学中，常用于测定蛋白质、核酸、酶等生物大分子的浓度。
例如，通过测量蛋白质在 280nm 处的吸光度，可以估算蛋白质的浓度。
分光光度法操作简便、快速，且灵敏度较高。
二、电泳技术电泳是指带电粒子在电场中向与其所带电荷相反的电极移动的现象。
在生物化学中，常用的电泳技术有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳常用于分离和分析 DNA 片段，根据 DNA 片段的大小不同，在凝胶中移动的速度不同，从而实现分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳则常用于分离蛋白质，能够分辨分子量差异较小的蛋白质。
三、层析技术层析技术是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离的方法。
常见的层析技术有凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
凝胶过滤层析根据分子大小进行分离，大分子先流出，小分子后流出。
离子交换层析基于分子所带电荷的不同来分离物质。
亲和层析则利用生物分子之间的特异性亲和力进行分离，具有很高的选择性。
四、离心技术离心是利用离心机旋转产生的离心力，使不同密度、大小的颗粒分离的技术。
在生物化学实验中，常用于分离细胞器、细胞组分、蛋白质复合物等。
差速离心通过逐渐提高离心速度，分步沉淀不同大小的颗粒。
密度梯度离心则是在离心管中形成密度梯度，使不同密度的颗粒在相应的密度区带中沉降，从而实现分离。
五、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 技术是一种用于扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术。
通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，使 DNA 片段呈指数级扩增。
PCR 技术在基因诊断、基因克隆、基因突变检测等方面有着广泛的应用。
六、酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA 是一种利用抗原抗体特异性结合进行检测的技术。
动物生物化学实验
动物生物化学实验1. 引言动物生物化学实验是研究动物体内生物分子的组成、结构和功能的重要手段。
通过实验可以深入了解动物体内的代谢过程、蛋白质合成、酶活性以及相关疾病的发生机制等。
本文将介绍一系列常用的动物生物化学实验方法和实验步骤。
2. 蛋白质含量测定实验2.1 实验原理蛋白质含量是衡量细胞或组织中蛋白质水平的重要指标。
常用的蛋白质含量测定方法有Lowry 法、Bradford法和BCA法等。
其中，BCA法是一种基于铜离子和比色反应的测定方法，具有灵敏度高、稳定性好的特点。
2.2 实验步骤•步骤1：制备待测样品。
将待测组织样品加入磷酸缓冲溶液中，用均匀器均匀打碎组织，使得细胞内的蛋白质充分溶解。
•步骤2：制备标准曲线。
选取一系列已知浓度的蛋白质标准品，分别加入不同浓度的BCA试剂，混匀后在37摄氏度下孵育一段时间，最后测定吸光度。
•步骤3：测定待测样品。
将待测样品加入BCA试剂中，混匀后在37摄氏度下孵育一段时间，最后测定吸光度。
•步骤4：计算蛋白质含量。
将待测样品的吸光度值与标准曲线相比较，根据吸光度值的差异计算待测样品中的蛋白质含量。
3. 酶活性测定实验3.1 实验原理酶活性测定是评估酶功能和酶水平的重要方法。
常用的酶活性测定方法有过氧化物酶（POD）活性测定、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定和碱性磷酸酶（ALP）活性测定等。
3.2 实验步骤以POD活性测定为例：•步骤1：制备待测样品。
将待测组织样品加入磷酸缓冲液中，通过离心等方法使得细胞内的酶充分溶解。
•步骤2：制备标准曲线。
选取一系列已知浓度的酶标准品，分别加入过氧化氢溶液和柱剂，混匀后在一定时间内测定吸光度。
•步骤3：测定待测样品。
将待测样品加入过氧化氢溶液和柱剂中，混匀后在一定时间内测定吸光度。
•步骤4：计算酶活性。
将待测样品的吸光度值与标准曲线相对比，根据吸光度值的差异计算酶的活性。
4. 代谢产物检测实验4.1 实验原理代谢产物是动物体内代谢过程的关键物质，其含量和比例变化可以反映动物的代谢状态。
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学(11)临床化学常用分析技术
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（11）临床化学常用分析技术一、光谱分析（分光光度技术）利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。
特点：灵敏、快速、简便。
是生物化学分析中最常用的分析技术。
分类（一）可见及紫外分光光度法分光光度法的理论基础是朗伯－比尔定律。
mber－Beer定律：A=k·b·cA为吸光度k—吸光系数b—光径，单位：cmc—溶液浓度，单位：g/L2.摩尔吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c＝1mol/L，b＝1cm时，则常数k可用ε表示。
3.比吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c为百分浓度（w/v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。
（二）原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。
即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。
常用的定量方法有：标准曲线法、标准加入法、内标法。
1.标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。
由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。
2.标准加入法：把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。
本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响，较为常用。
3.内标法：在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。
以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。
标准曲线的绘制吸光度标准曲线绘制
标准曲线的绘制-吸光度标准曲线绘制生物化学实验报告ALT与其吸光度的标准曲线绘制采集样本：广西医科大学口腔医学2016级13班四个组中7组生物化学实验数据采集时间：2016年11月15日2016~2016上学期第十一周周一下午采集人：何洁梅一、几组ALT与其吸光度的标准曲线数据记录ALT活力单位A520吴修团1组A520黎丁菱1组A520杨璇璇1组A520谢晓兰2组A520莫雪玲2组A520李文良3组A520文全海4组00000000二、各采集样本汇总图样本1测定得待测血清ALT活力单位为50U/L样本2测定得待测血清ALT活力单位为97U/L样本3测定得待测血清ALT活力单位为135U/L样本4测定得待测血清ALT活力单位为70U/L样本5测定得待测血清ALT活力单位为148U/L样本6测定得待测血清ALT活力单位为45U/L样本7测定得待测血清ALT活力单位为98U/L四、采集数据处理结果分析1．数据总结样本编号测定的ALT活力单位是否大于40U/L正常/非正常150是非正常297是非正常3135是非正常470是非正常5148是非正常645是非正常798是非正常平均值92均为“是”均为“非正常”2.针对数据处理结果的分析采集的7组数据经标准曲线测量后，得到的ALT活力单位值均大于40，即均为非正常值，综上，认为待测血清中ALT 含量超于正常值。
3.针对源数据的分析采集的7组数据中样本4、5、6的数据经画图后可基本分布呈过原点的线性关系，符合理论规律，但其他的数据误差较大。
另外，比较符合理想标准曲线的4、5、6样本的三个ALT活力单位值也存在较大的出入。
4.经分析，总结可能的误差来源如下配置丙酮酸标准溶液、底物溶液、磷酸缓冲液的混合溶液时，丙酮酸标准溶液的剂量都很小，容易造成误差。
加入2,4—二硝基苯肼的时间可能有误差，保温的时间，以及加入NaOH 以停止反应的时间都有可能有偏差，容易造成较大。
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验1.分光光度计（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中,其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比,即遵循朗伯—比尔定律,通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度;（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比,称为朗伯—比尔定律,简称比尔定律,即光的吸收定律;其数学表达式为：A＝-lgT＝εbcA：吸光度,又称光密度“”；ε：吸光系数L·mol－1·cm－1；比例常数,称吸光系数b：样品光程cm,通常使用的吸收池,则b=1cm；c：样品浓度mol/L;吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和;这是多元混合物分光光度法定量分析的基础;若溶液中各溶质的吸光系数ε相同,则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例;例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为,用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为,已知其摩尔吸光系数 = ×103 M-1cm,计算其摩尔浓度.∵A＝εbC∵A＝溶剂加样品的吸光度－溶剂的吸光度∴A＝－＝∵b＝1cm∴C==×10-5 mol / L2等电点的计算方法；标准曲线的制作1配置一系列浓度不同的标准溶液;2在测定条件相同的情况下,分别测定其吸光度;3以标准溶液浓度为横坐标不必考虑显色剂等引起的浓度变化,以相应的吸光度为纵坐标,绘制A-C关系图;4在相同条件下测出样品溶液的吸光度,从标准曲线上查出浓度;2、酪蛋白的提取过程：1.原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,它是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为; 利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质,将牛乳的PH调至时,酪蛋白就沉淀出来;用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白;2.主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液,PH４.6,乙醇,乙醚,氢氧化钠PPT后面问题：1醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么醋酸缓冲液：调节PH到等电点;蒸馏水：出去沉淀中的可溶物;乙醇：除去沉淀中的脂类物质;丙酮洗涤：脱水;2最后所得的沉淀中加入L NaOH的作用是什么酪蛋白是酸性蛋白质,溶解于碱性溶液中,方便下次双缩脲法测定;3制备高产率酪蛋白的关键是什么刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到,越接近越好,这是最主要的;4请设计另一种提取酪蛋白的方法;1、向酪蛋白溶液中加入高浓度NH42SO4溶液2、10000转/分,5分钟,去上清液3、95%乙醇4ml洗涤离心,10000转/分,5分钟,去上清液4、丙酮4ml洗涤离心,10000转/分,5分钟,去上清液5、LNaOH2ml加水至10ml3、双缩脲法测蛋白质含量1.蛋白质测定的5种方法:凯式定氮法Kjedahl法紫外吸收法双缩脲法Biuret法Folin-酚试剂法Lorry法考马斯亮蓝法Bradford法TCA：三氯乙酸4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色;在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比;1.干扰物质有哪些TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等2.G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基,染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍;优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色;所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析;3.PPT后的4个思考题;说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量,哪几种只能测定其相对含量,为什么只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量,因为每蛋白质含1g氮,试验中可以除去非蛋白氮,所以,通过氮含量的测定,可以得到蛋白质的绝对含量;其他的几种方法,由于都使用了标准蛋白制作标准曲线,所以,所测得的未知蛋白的含量,都是相对于标准蛋白含量而言的;考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差,最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白;2仍有一些物质干扰此法的测定,主要的TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等; 3标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度;在实验中,使用的水一定是蒸馏水吗为什么因为Bradford检测中要用的试剂配制,标准曲线的制作都要用到水.如果不是使用蒸馏水,可能水里面会有一些游离的离子或者电解质,会影响试剂配制的准确性,干扰实验结果.而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应,这样制作的标准曲线会比实际值偏高,导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低;SDS干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小;但是随着SDS浓度的增加,吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律;由于SDS的存在,阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合,使得吸光度减小;由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合,使得显色减弱,吸光度值降低,因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键,使得蛋白质的空间结构更加伸展,一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来,所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时,过量的SDS就不起作用了,曲线是最后为平缓段;要去除SDS的干扰,可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除;K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰;5、醋酸纤维薄膜电泳原理：生物分子在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向不同分子以不同速度移动;电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、自身大小和形状；此外还受外界因素的影响如,电场强度、溶液的PH、离子强度等;1.结合实验报告册,回忆操作过程,首先醋酸纤维薄膜先看粗糙面,在粗糙面上画点样线,画好后做标记,泡在缓冲溶液中浸泡完全上面无白斑,然后点样,点样后放掉电泳槽中电泳,电泳后染色,然后脱色;熟悉整个过程,如果把过程打乱,能否正确排序选择题结果是5条带,哪条带最接近点样线,哪条线最远;要求会画图,画图要记得画点样线;2.血清蛋白的临床意义;组成：白蛋白、α1、α2、β和γ-球蛋白;功能：维持血浆胶体渗透压；调节血浆pH值,维持酸碱平衡；运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等；免疫作用;血清蛋白是血浆中最主要的固体成分,含量为60～80g/L减少：长期慢性发热、大面积烧伤白细胞增多, 恶性肿瘤、肝癌淋巴细胞和核细胞增多 , 肝功能严重受损、肝坏死、肝硬化谷丙转氨酶增多 , 甲状腺功能亢进、浆膜渗出性损害、结核病、慢性腹泻、慢性肝炎、肾病综合征、吸收不良综合征 , 营养不良、贫血红细胞,红蛋白稍偏低等;增加：大量出汗、多发性骨髓瘤、腹泻、巨球蛋白血症、严重呕吐、中毒等;6、血糖测定吴宪血糖测定法1.吴宪血糖测定法的优势波长620nm:优点：灵敏度高,比双缩尿法灵敏得多工作原理：葡萄糖＋ CuOH2→ Cu2O↓Cu2O ＋磷钼酸→钼蓝钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比,所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定血糖的含量波长620nm;2为什么选用无蛋白血滤液有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应,也呈蓝色,干扰最后的结果3水浴8min后,取出为何切记摇动氧化亚铜易已被氧化4空腹血糖的正常范围：一般空腹全血血糖为～L70～110毫克/分升,血浆血糖为～L70～125毫克/分升; 空腹全血血糖≥L120毫克/分升、血浆血糖≥L140毫克/分升,2次重复测定可诊断为糖尿当空腹全血血糖在L100毫克/分升以上,血浆血糖在L115毫克/分升以上,应做糖耐量试验;当空腹全血血糖超过L200毫克/分升时,表示胰岛素分泌极少或缺乏;因此,空腹血糖显着增高时,不必进行其它检查,即可诊断为糖尿病;5PPT后的3个思考题Folin-吴宪法为什么要用无蛋白血滤液有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应,也呈蓝色,干扰最后的结果Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么优点：灵敏度高,比双缩尿法灵敏得多,缺点是费时,要精确控操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性比较差,干扰物质比较多进行比色法测定时,如果测得样品的A值超过100%,该如何处理,为什么测得样品值超过100%是因为有其它还原物质,使其待测液中血糖的浓度过高所造成的,应该将待测液稀释后再进行比色 ;7、谷丙氨酸酶的临床意义；1、谷丙氨酸酶的测定方法；知道什么是赖氏法,什么是改良赖氏法2、改良后的方法优势在哪1.反应温度：40℃改为37℃；2.底物浓度：高改低；3.套用卡门氏单位,与速率法一致,反映了酶的真实活性3、在做实验时用到α—酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼,他们的原理以及试剂的作用；4、该实验的注意事项：2,4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血标本不宜采用,因血细胞内转氨酶活力较高,影响测定结果；在测定时,如酶活力较大大于150KarU ,应将样品稀释后再进行测定;5、PPT后的6个思考题1、ALT的临床意义AST的测定对于肝病的诊断具有十分重要的意义,特别是AST/ALT比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义,是临床诊治肝病的重要指标之一2、血清谷丙转氨酶测定的注意事项以及为何要避免溶血常温下标本不宜久存,2严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度,测定这类标本应做血清标本对照组3当标本的酶活性超过150K时,应将血清中用L氯化钠稀释重做,其结果乘以稀释倍数4酮戊二酸,2,4-二硝基甲苯肼是直接显色物,NAOH的浓度与显色深浅有关,因此它们的浓度必须很准确5丙酮酸标准浓度要求十分精确6加入2,4-二硝基苯肼溶液之后应充分混匀当溶血之后,红细胞中的ALT会进入血液中,导致测得的实验数据较大,不符合实际情况3、对照管的意义是什么减少非试验因素对实验结果的影响4、底物液为何要37℃预温5min人体的体温为37℃,只有在此温度下酶的活性才会达到最大,因此必须先让酶的活性达到最大才与底物反应5、为什么在制作标准曲线时要加入基质液使反应的溶液体积相同,减少因体积不同而造成的实验非决定性因素的影响6、为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同,对反应没有影响基底液与底物和酶都不反应,它的作用只是调节溶液的体积酶活性的单位：国际单位：1961年酶学委员会建议使用统一单位,在规定条件下,1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量,称为一个国际单位IU,又称U;8、猪肝ＤＮＡ基因组ＤＮＡ的提取实验原理一定要掌握;提取过程中用到的试剂作用；PPT后的思考题（1）实验原理：DNA与RNA的分离： DNP在 NaCl盐溶液中溶解度很低,而RNP则溶于盐溶液,利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开;DNA在高浓度的盐溶液中溶解度最大;去除DNP中的蛋白：SDS使之变性除去同时破坏核酸分解酶;进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白,震荡时,蛋白质变性,形成凝胶,并与DNA分开,DNA则留在水层中;沉淀DNA：利用DNA不溶于乙醇,因而用乙醇将DNA 从溶液中沉淀出来;提取过程中用到的试剂作用1、取新鲜猪肝4g,用L LEDTA溶液洗去血液,剪碎;加入10mL L L EDTA溶液,置匀浆器中研磨;初步破碎细胞;已做2、取一支10 mL EP管,装入糊状物基本装满,离心5 min10000rpm,弃去上清液; 沉淀用l L EDTA溶液洗两次;每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心同上,直到上清液无血细胞;弃上清液,所得沉淀为DNPDNA蛋白复合物粗制品3、向上述沉淀物加入L NaCl L EDTA溶液5mL,然后每管滴加25%的SDS溶液1mL,边加边振荡;加毕,置60℃水浴10min 不停振荡,直至溶液变得粘稠并略透明,取出冷却至室温;此步骤使核酸与蛋白质分离;4、每管加入5 mol/l NaCl溶液2mL,蝴蝶形振荡5min;加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液,蝴蝶形振荡5min,离心10min4000rpm; 此步骤后溶液分三个相：上层水相DNA；中层变性蛋白质相；下层有机相和残余的RNA;5、吸出上清液,弃去沉淀;向上清液中缓慢加入—2倍体积的95%乙醇,DNA沉淀析出,离心4000rpm5min用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA6、制备DNA溶液：用L的NaOH 1mL,溶解DNA沉淀,为下次的DNA含量测定提供材料PPT后的思考题1.核酸提取中SDS、氯仿-异戊醇各有什么作用SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构;而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂;在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异;氯仿可去除DNA溶液中微量酚的污染,异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡2.结合本人操作的体会,试述在提取过程中应应该注意些什么且如何避免大分子DNA的降解和断裂震荡过程中力度不能过大,力度过大会导致DNA分子断裂,也会影响实验的结果;离心时间应适合,时间太长可能会导致DNA分子断裂,时间太短,会导致DNA分子不能得以与蛋白质分离,水浴时间与温度应该适宜,温度为65度时间为6分钟最适合;3.核酸提取过程中,除去杂蛋白的方法主要有哪几种4种：紫外线吸收法,定磷法,二苯胺法,地衣酚苔黑酚法4.预习：核酸定量测定方法有几种9、DNA样品含量的测定有5种方法；我们做了紫外法和二苯胺法,其他方法要掌握实验原理,做实验的两种方法不仅要掌握实验原理,还要掌握操作过程;二苯胺法实验原理脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应,在595nm处有最大光吸收; DNA在40-400ug范围内,光吸收与DNA的浓度成正比;在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度;除DNA外,脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应;其他多数糖类,包括核糖在内,一般无此反应;紫外吸收法实验原理 DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,它们的吸收高峰在260nm波长处;吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性10、质粒DNA提取掌握实验原理,试剂的作用；什么叫做质粒质粒的结构质粒有什么特点我们用碱裂解法,该法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；以及最后的实验步骤和注意事项；PPT后的3个思考题;二苯胺法实验原理脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应,在595nm处有最大光吸收; DNA在40-400ug范围内,光吸收与DNA的浓度成正比;在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度;除DNA外,脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应;其他多数糖类,包括核糖在内,一般无此反应;质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子;碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们质粒的结构特点：1、染色体外的小型DNA分子；2、共价闭合环状超螺旋结构;3、自主复制;作用： 1、外源DNA的载体 2、保存基因 3、表达蛋白用碱裂解法,该法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成保护、缓冲①50 mmol/L葡萄糖的作用是增加溶液的粘度悬浮细胞②25 mmol/L EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用保护作用③10 mmol/L Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围缓冲作用溶液II：由SDS十二烷基硫酸钠与 NaOH 组成裂解、变性① mol/L SDS：②1% NaOHPH>12：破坏细胞膜,裂解细胞注意：碱裂解的时间不要太长,以免基因组DNA断裂成小片段;溶液III： 3mol/L HAc 和 3mol/L KAc 组成的高盐溶液复性,分离①HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性,使染色体DNA 变性而发生缠绕,并使质粒DNA复性;②KAc会与SDS形成溶解度很低的盐POD十二烷基磺酸钾,并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离;PPT后的3个思考题;质粒提取除了碱裂解法,还有其他什么方法各种方法的优缺点核酸提取过程中,除去杂蛋白的方法主要有哪几种如果质粒DNA中有蛋白质残留,如何判断在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂11、PCR技术知道操作中加了哪些试剂试剂的作用是什么PCR的原理主要是3个步骤：变性,退火,延伸;过程是什么样的PCR的特性;1、过程：首先95℃预变性设置1min,1min后94℃ 30s进入变性过程；然后是退火52℃ 30min；然后引物的延伸,72℃ 30s,从这开始循环,72℃ 10min,最后0℃保温;2、试剂的作用是什么一DNA聚合酶Taq DNA聚合酶的用量为1～100ul,酶的浓度偏高,非特异性的产物将会增加,若酶的浓度偏低,侧合成产物偏少;Taq DNA聚合酶可分为两大类：1、具有校正功能的有3'→5'核酸酶活性比如：Vent,pfu,pwo等2、不具有校正功能的无3' →5'核酸酶活性比如：一般的Taq DNA聚合酶二模板核酸模板的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本;一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增;RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA;三引物引物是待扩增核酸片段两端的已知序列,它决定了PCR扩增产物的大小,引物的选择是整个PCR反应的关键,引物的优劣直接关系到PCR的特异性及成功与否; 引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;2、PCR的原理主要是3个步骤：变性,退火,延伸;过程是什么样的过程：首先95℃预变性设置1min,1min后94℃ 30s进入变性过程；然后是退火52℃ 30min；然后引物的延伸,72℃ 30s,从这开始循环,72℃ 10min,最后0℃保温1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;3、PCR的特性1、特异性强：PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、Taq DNA聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性;2、灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的;3、简便快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA仪中进行变性、退火、延伸反应,一般在2～4h完成扩增反应;4、对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总DNA均可作为扩增模板;可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测12、琼脂糖凝胶电泳什么叫电泳琼脂糖凝胶电泳的优缺点,应用范围；知道凝胶制备过程；操作过程中的注意事项；PPT后后的思考题1、电泳的分类方法：1、按支持物的物理性状不同,区带电泳可为：滤纸及其他纤维：如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维；凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等；丝线电泳：如尼龙丝、人造丝电泳;粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；2、按支持物的装置形式不同,区带电泳可为：平板式电泳：支持物水平放置最常用；垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳；垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；连续液动电泳：首先应用于纸电泳,将滤纸垂直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流,与电泳方向垂直;2、DNA在琼脂糖电泳中迁移速率受哪些因素影响①分子量大小；②空间构型；③琼脂糖浓度；④缓冲溶液离子浓度；⑤电压合成染料的作用；操作过程中的注意事项；凝胶浓度选择根据DNA分子大小而定；用微波炉熔化琼脂糖时,避免产生气泡,琼脂糖溢出；凝胶冷却至60℃左右,立即铺胶,以防凝固；上样前检查样品孔内是否有气泡并设法排除；电泳前,确认样品孔位于电场负极；3、PPT后后的思考题DNA琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系如何琼脂糖凝胶电泳有哪些优点优点：1醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象;2快速省时;3灵敏度高,样品用量少;4应用面广;缺点：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物;太厚吸水性差,分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎;血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱分离不清或不整齐,最常见的原因有哪些1、醋酸纤维素薄膜未充分浸透后就开始点样;2、点样时,未将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,导致样品扩散;3、点样时,动作不娴熟,用力太大;4、点样前沿要平,点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键;5、点样量未控制好;6、通电过程中,取出或放入薄膜导致电泳不完全;。
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负偏离
依据Beer定律，A与
C关系应为经过原点 的直线
偏离Beer定律的主要
因素表现为以下两个 方面：
1. 光学因素
2. 化学因素
溶液本身的化学因素引起的偏离
(1)溶液介质不均匀引起的
实验的化学条件对化学平衡的影响；
(2)溶液的浓度
被测物浓度大时，吸光微粒间的平均距离减小， 使相邻微粒的电荷分布互相影响，从而改变其对光 的吸收能力；
可见光。白光是由红橙黄绿青蓝紫七种不同颜 色的光按一定强度比例混合而成，称为复合光， 只有一种颜色的光即单一波长的光称为单色光。
互补色光：适当颜色的两种单色光按一定的
强度比例混合可以成为白光,这两种单色光叫 互补色光，这两种颜色称为互补色。如绿光和 紫光互补，黄光和蓝光互补等。
不同颜色的可见光波长及其互补光
度、波长有关；
当一束平行的单色光通过均匀透明的溶液时，该溶液对 光的吸收程度与溶液中物质的浓度和光通过的液层厚度 的乘积成正比。
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc
吸光度(Absorbance ，A) 的测量
1、透光率（transmittance，T）与吸光度(Absorbance ，A)
Welcome to Biochemistry Laboratory
生物化学实验
武汉大学基础医学院 生物化学与分子生物学系
实验室规则
预习 1、实验前需
实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、步骤及注意事项。
2、实验要严肃认真按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，如实记录 实验数据和结果，根据实验结果进行科学分析。
理想标准曲线的特点
过原点的直线; 斜率为1； 浓度为待测物质浓度
的一半～二倍；
A在0.1～ 0.7之间；
mg/ml
理想标准曲线的应用
1、定量－查找法； 2、鉴定所用方法是否复合L－B定律； 3、检查试验者其操作及实验条件等控制是否
正确无误； 4、确定待测物的最大浓度；
偏离Lambert – Beer定律的原因
光的能量与其频率成正比，与波长成反比。
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见
（真空紫外）
近红外 中红外 远红外
10nm~200nm 200nm 380nm 780 nm
2.5 m
50 m
~380nm ~ 780nm ~ 2.5 m ~ 50 m ~300 m
可见光：人眼能感觉到的光（380~780nm）叫
吸收光谱(absorption spectrum)
概念 将不同波长的光依次通过固定浓度的有色溶液，然后每一
波长下测量相应光的A，以波长为横坐标A为纵坐标作图，可得一 曲线－光吸收曲线(absorption curve)。也称吸收光谱曲线。
特征
选择性吸收：吸收范围、强弱； 吸收的波形与物质性质有关，与浓度无关； A值最大时的波长称λmax；在λmax时测量A灵
透 镜
光屏
M1
波长范围宽, 色散均匀,
分辨性能好, 使用方便. M2
出
光栅衍射示意图
射 狭
缝
吸收池
3、吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池
注意事项：1）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液体的体积装满比色杯的3/4。 3）不要将比色杯放在分光光度计上。
7、所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱 必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
8、严谨、严肃、细致、序！
分子生物学实验室规则
1. 进入实验室必须穿工作服，长头发要扎起来，不能穿露趾鞋子。 严禁在实验室吃喝或嚼口香糖、存储食品饮料、嬉笑打闹。背包 等个人物品请放在教师指定的位置。
比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的 ,液层厚度b 一定时,溶
液的吸光度A与吸光物质的c成正比.
光吸收基本定律:Lamber-Beer定律
A=kbc
A — 吸光度(absorbance) b — 溶液厚度(length/cm) c — 浓度(concentration) k — 吸光系数(absorptivity)与物质性质、温
A在0.1～0.7之间较为准确有效；
(二)标准管对照法
先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶
液(其浓度用c标表示)，在λmax处测出吸光 度A标，在相同条件下测出试样溶液的吸光 度A测，则试样溶液浓度c测可按下式求得：
c测＝ (A测/ A标)* c标
(三)利用消光系数求样品含量
摩尔消光系数ε C＝A/ε
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
白光
800
λ1
600
500
入射狭缝 准直透镜
λ2
400
棱镜
聚焦透镜 出射狭缝
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等 间距条痕(600、1200、2400条/mm )。
利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。
－平面透射光栅
平面透
射光栅
－反射光栅（广泛使用）
校验微量移液器
在精密度为0.0001g的天平上校验。1ml水重量为1g，1µl的水重量为0.001g。 可以去皮后称重，检验微量移液器的准确性。当微量移液器准确性高时，可以 评估实验者的操作是否准确和精细。
实验考试和考核方法
总分100分
实验笔试 ：70％ 实验报告：15％ 平时成绩：15％
实验报告要求
1、实验题目，时间，实验者姓名 2、目的 3、原理（简单明了） 4、操作不写 5、结果，定性要分析，定量要列表 6、讨论：总结分析
生物化学技术
吸收光谱法 电泳技术 层析技术
酶学分析技术 分子生物学实验技术
（吸光光度法）
光谱分析技术
发射光谱：原子发射光谱法、火焰光度 法、荧光光谱法 吸收光谱：紫外及可见分光光度法、原 子吸收分光光度法、红外光谱法 散射光谱：比浊法
Concentrate on work!
3. 玻璃制品使用前要检查。发现玻璃制品有缺口或裂缝勿继续使用
，并报告指导老师。勿徒手取破玻璃。 4. 小心拿放加热的玻璃器皿，必要时使用夹钳或防热手套。
5. 吸取试剂前一定看清试剂容器的标签，吸取所需体积，勿浪费 试剂。多吸取的试剂不能放回原来的试剂容器中。 6. 实验中出现任何危险情形(如泼溅、破损、割伤、烫伤等)要立 即通知指导老师。 7. 经过实验老师的同意和指导，不得擅自使用实验室内仪器或接 触化学试剂和其他实验物品。 8. 清洁：实验结束后要按照老师要求做好清洁，拔掉电器插头， 收好实验相关物品。做完实验后清洗双手。
3、实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。
4、节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作，实验完毕，仪器关机回位。
5、严禁在实验室饮水、吃零食！实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水 源，确保安全。
6、若发生酸碱灼烧事故，即用大量自来水冲洗，酸灼伤者用饱和NaHCO3溶液中和， 碱灼伤者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。
第一停点 第二停点
Tip头
A. 保持微量移液器垂直，将按钮压至第一停点； B. 微量移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮； C. 保持微量移液器垂直，将微量移液器头与容器壁接触，
慢慢压下按钮至第一停点； D. 压至第二停点把溶液完全释放出； E. 释放按钮回原状。
注意：
1．未装Tip头的微量移液器绝对不可用来吸取试剂。 2．选择适当量程的微量移液器取样，在允许量程范围内设定容量。 3．不要横放或倒拿带有残余液体吸嘴的移液器。 4．禁止调节读数超出移液器量程（造成内部弹簧锁死→损坏）。 5．使用完移液器后，应将刻度调回最大刻度存放。
敏度最高。
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱 (Absorption spectra of Cr2O72-、MnO4- )
525 545
1.0 350 Cr2O72-
0.8
MnO4-
0.6
0.4
440 nm
Absorbance
0.2
350
400
500
600
700 /nm
同一物质不同浓度的溶 液，光吸收曲线形状相 似，其最大吸收波长不 变；但在一定波长处吸 光度随溶液的浓度的增 加而增大。
分光光度计简介
分光光度计的主要部件
Section 3
氙灯
氢灯
钨灯
光源
发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源
氙灯
氢灯
钨灯
棱镜
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃350～3200nm, 石英185～4000 nm
漏水！ 现在的实验垃圾主要为普通垃圾，如有生物垃圾老师会提醒。
微量移液器的使用
微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器。微 量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调节读数。
分生实验室常用规格 0.5～10 μl 10～50 μl 20～200 μl
100～1000 μl
微微量量移移液液器器的的操操作作步骤：
吸收光谱法
基于物质对不同波长的光具有选择性吸收 而建立起来的分析方法，包括比色法、可见 光及紫外分光光度法、红外光谱法等。
吸收光谱
Lambert-Beer定律 分光光度计简介
吸收光谱法的应用
吸收光谱
Section 1
光的基本性质 光的波动性： C＝λν 光的粒子性： E=hv=hc/λ
E 为光电子能量；v 为频率；h 为普朗克常数； c为光速;λ为波长(nm)。