淀粉酶活的测定

α－淀粉酶活力的测定

一、实验目的

通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。

二、实验原理

α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

三、实验试剂和仪器

（一）试剂

1. 原碘液

称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2. 稀碘液

吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

3. 20g／L可溶性淀粉溶液

称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。

注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。

4. 磷酸缓冲液（pH6.0）

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。配好后用pH计校正。

（二）仪器

1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定

2. 秒表

3. 恒温水浴（60±0.2）℃

4. 试管25mm×2000mm

四、实验步骤

1. 待测酶液的制备

称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2. 测定

（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。

（2）加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻记时，摇匀，准确反应5min。

（3）立即吸取反应液1.00mL于稀碘液5.00mL中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度（A）。根据其吸光度查表，求得测试酶液的浓度（C）。

五、实验结果整理

样品酶的活力根据以下公式计算：

X=c×n

式中：X－样品的酶活力[IU/g(IU/mL)]

c－样品酶液的浓度(IU/mL)

n－样品的稀释倍数

所得结果表示至整数。平行实验相对误差不得超过2%。

本文研究了麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖等作为碳源在不同浓度下对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细胞生物量及其培养基pH值的影响。结果表明:乳糖浓度为3%时,酶活力最高,为90.6±0.7U/mL。麦芽糖浓度为2%时,酶活力最高,为67.2±0.6U/mL;果糖浓度为4%时,酶活力最高,为38.0±3.7U/mL;葡萄糖浓度为4%时,酶活力最高,为23.2±0.3U/mL;蔗糖浓度为4%时,酶活力最高,为24.7±0.5μ/mL。枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶可能受乳糖的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用。发酵液前后的pH值没有显著的差异。细胞生物量也差别不大。该研究为进一步提高枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶酶活,提供了实践及理论意义。

α-淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,其系统名称为α-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,是一种内切淀粉酶。它可以随机的方式切断淀粉分子内的α-1,4葡萄糖苷键,生成糊精和还原糖。α-淀粉酶是目前世界上较早生产、产量较大的工业酶制剂之一,在食品、纺织、医药和饲料等工业中都有

测定时注意事项：

1．底物浓度除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10～20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。

2．酶浓度在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。

3．温度不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l～2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。

4．离子强度和pH值在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5～8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积／反应液体积≤1／10为宜。

5 辅助因子某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如

Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。

6．激活剂有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。

7．抑制剂酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+，K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。

综上所述，测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。