实验七尿淀粉酶活性测定
血、尿液淀粉酶AMS两点法测定-检验科生化室作业书
血、尿液淀粉酶AMS两点法测定1.实验原理VitrosAMS试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。
将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。
分布层含有反应所需的染色淀粉底物（与支链淀粉共价化合），样品中的淀粉酶催化该染色淀粉水解成更小的有色糖。
随后这些有色糖进入下面的试剂层。
分别在孵育2.3分钟和5分钟时用反射仪测定试剂层中有色糖的反射强度，两次读数间的差值与样品中的淀粉酶活性成正比。
测定方式：两点法波长：540nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：淀粉酶染色支链淀粉——————→有色糖2.标本：2.1病人准备：无特殊。
2.2样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。
定时收集的，稀释后的尿样。
2.3标本采集与处理：2.3.1血清和血浆样品血浆中淀粉酶活性约比血清中高20U/L。
不能使用钙螯合物作抗凝剂，如草酸，枸橼酸和EDTA。
样品采集后4小时内要离心标本，吸出血清。
处理样品时要将其当成生物污染品。
2.3.2尿液样品定时或随时采集的尿液，特别要注意的是：含有冰醋酸，浓盐酸或者防腐剂中有乙二羟化四甲铵和氧化汞的样品不能测淀粉酶。
尿液样品在测试前要冷藏在2～8℃。
处理样品时要将其当成生物污染品。
3.标本的存放：血清、血浆、尿液室温下最多7天；4～8℃冷藏最多1个月；样品不可冷冻保存。
4.标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。
5.标本拒收的标准：污染、抗凝剂、防腐剂不符合要求，标本放置时间过长。
6.试验材料：6.1测试AMS所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros7%BSA稀释液。
强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.1试剂组成：干片成分：反应成份是染色支链淀粉。
其它成份有染色剂，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，稳定剂和媒染剂。
实验七 淀粉水解试验
3、试剂:卢哥氏碘液。 4、实验用品：平皿,接种环,酒精灯,
试管,接种针等。
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淀粉培养基（pH7.2）
蛋白胨
10g
NaCl
5g
牛肉膏
5g
可溶性淀粉
10g
琼脂
15g
H2Oቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1000ml
应用少量水先将可溶性淀粉溶解
3、培养:将接种后的平皿置于37 ℃恒温箱培养24h。
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4、检测:取出平板,打开平皿盖, 滴加少量的碘液于平板上,轻轻 旋转,使碘液均匀铺满整个平板. 菌落周围如出现无色透明圈,则 说明淀粉已经被水解,表示该细 菌具有分解淀粉的能力。可以用 透明圈大小说明测试菌株水解淀 粉能力的强弱。
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四、实验步骤
1、准备淀粉培养基平板: 将熔化后冷却至50℃左右 的淀粉培养基倒入无菌平 皿中,待凝固后制成平板。
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2、接种:用记号笔在平板底 部划成两部分,在每部分分别 写上菌名,用接种环取少量的 待测菌,点接在培养基表面的 相对应部分的中心,其中一个 菌种应是枯草杆菌做对照菌。
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五、作业 题
绘图表示淀粉水解试验的实验结果
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实验七 淀粉水解试验
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一、目的要求 1、检测细菌能否产生淀粉酶和 利用淀粉的能力。 2、学习点接法接种。
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二、实验原理 有些细菌具有合成淀粉酶的能力， 可以分泌胞外淀粉酶.淀粉酶可以 使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,淀 粉水解后遇碘不再变蓝色。
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三、仪器和材料
1、活材料:大肠杆菌(E. coli),枯草 杆菌(Bacillus subtilis),
实验七 尿淀粉酶活性测定
实验七尿淀粉酶活性测定淀粉酶(AMY或AMS)在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的α—1，4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。
血清中的淀粉酶主要有胰型(P型)和唾液型(S型)及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾液腺。
正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。
【目的】1、验证淀粉酶的催化作用。
2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。
【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。
Winslow氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的37℃、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml尿液中的淀粉酶活性。
【器材】试管（10mm×100mm）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。
【试剂】1、9%NaCl2、0.3%碘液3、0.1%淀粉溶液【操作】1、准备尿液（自备）。
2、取10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。
3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。
吸出此混合液1ml移入第二管中。
4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml置于第三管中。
依此类推，如此继续稀释至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml,……1/512ml的不同浓度的尿稀释液。
第十管不加尿液作为对照管。
5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往往是实验成败的关键！），置37℃水浴中，确保30分钟。
6、取出各管后，立即向各管中加入0.3%碘液2滴，摇匀后观察各管的颜色。
*注：各管依次出现黄到蓝的色序，黄色表明无淀粉存在，浅红色紫色表明有淀粉的水解中间产物，兰色表明有淀粉存在。
淀粉酶活力的测定
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
1、分别计算0时刻、5 min时刻的A540nm平均值。 2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二
硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准 曲线，计算淀粉酶的活力。
需要详细过程。
5 min时刻吸光值
5 min时刻还原糖mg数
0 min时刻吸光值
0 min时刻还原糖mg数
二者相减，计算酶活力。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶*稀释倍数
七. 思考题
1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？ 2、本实验中两次加入NaOH溶液的意义是什么?
八、分析
1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？ 2.酶液的稀释倍数是否要改变。 3.计算酶液的总活力、回收率。
操作
0号管 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’
淀粉酶液 (ml)
0.3
0.2
0.5
H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液 0.3 ％ NaCl
预热
各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min
实验七 淀粉酶活力的测定
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
二、实验原理
淀粉酶活性的测定
实验七 淀粉酶活性的测定一、目的淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可以分成a淀粉酶，b淀粉酶等。
a淀粉酶和b淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。
b淀粉酶存在于休眠的种子中，而a淀粉酶是在种子萌发过程中形成的，本实验的目的在于 掌握这两种酶的提取和测定方法。
二、原理a淀粉酶和b淀粉酶，各有其一定的特性，如b淀粉酶b淀粉酶不耐热，在高温下易钝 化，而a淀粉酶不耐酸，在 pH 3.6 以下则发生钝化，在萌发种子的提取液中，这两种淀粉 酶同时存在。
可利用这两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另一种酶的活性。
测定a淀粉酶活性时，可将提取液加热到 70℃维持 15 分钟以钝化b淀粉酶，而测定b淀粉 酶时，可用 pH 3.6的醋酸缓冲液处理提取液，以钝化a淀粉酶。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用 3, 5二硝基水扬酸试剂测定，由于麦芽糖能将后 者还原生成硝基氨基水扬酸的显色基团， 其颜色的深浅与糖的含量成正比， 故可求出麦芽糖 的含量。
常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。
在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。
并且在酶的作用过程中，四支测定管及 空白管不要混淆。
三、实验材料、仪器和试剂1．实验材料萌发的小麦种子（芽长 1 厘米左右）2．仪器（1）小台秤（2）研钵（3）容量瓶：50ml ´1, 100ml´1（4）具塞刻度试管：15ml ´6（5）试管：8 支（6）刻度吸管：1ml，2ml，10ml（7）离心机（8）恒温水浴（9）分光光度计3．试剂（1） 1%淀粉溶液, 称取1克可溶性淀粉, 加入80ml左右蒸馏水, 在电炉上加热溶解, 等 冷却后, 定容到 100ml。
尿液淀粉酶活力测定实验
实验十五
尿液淀粉酶活力测定 （Winslow）氏法 ）
原理：
临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清 氏法测定尿或血清 临床上通常用 中淀粉酶活性。 中淀粉酶活性 。 该法对淀粉酶活性单位的 规定是： 分钟， 规定是：在37℃，30分钟，恰好能将 ℃ 分钟 恰好能将0.1% 淀粉溶液1m1水解 （ 指加入碘液后不再呈 水解（ 淀粉溶液 水解 兰色或红色）的酶量定为一个活力单位。 兰色9%NaC1； ； 2.0.1%淀粉； 淀粉； 淀粉 3.碘化钾一碘溶液 （ 20KI和 10g碘溶于 碘化钾一碘溶液（ 碘化钾一碘溶液 和 碘溶于 100m1水中，使用前稀释 倍）； 水中， 水中 使用前稀释10倍 4.移液管； 移液管； 移液管 5.试管； 试管； 试管 6.恒温水溶锅。 恒温水溶锅。 恒温水溶锅
操作：
1. 取 10 支 试 管 ， 按 次 序 记 上 号 码 ， 各 加 0.9% NaCl 1 m1。 。 2. 用 1m1 移液管 加尿液 加尿液1m1 于第 一管 ， 使其与 0.9%；NaC1混合（若尿液中含淀粉酶过多，应 混合（ ； 混合 若尿液中含淀粉酶过多， 预先将尿液适当稀释） 用移液管吸取， 预先将尿液适当稀释 ） 。 用移液管吸取 ， 然后 任其流出。反复三次，使全管混匀。 任其流出。反复三次，使全管混匀。 从第一管吸出1m1到第二管中，混匀。吸出 到第二管中， 从第一管吸出 到第二管中 混匀。吸出1m1 到第三管……依次类推。到第九管吸出 依次类推。 弃之。 到第三管 依次类推 到第九管吸出1m1弃之。 弃之 这 样 即 可 获 得 分 别 含 有 尿 液 1/2 、 1/4 、 1/8……1/512 m1的不同浓度的尿稀释液 ， 第 10 的不同浓度的尿稀释液， 的不同浓度的尿稀释液 管不加尿液作为对照管。 管不加尿液作为对照管。
实验十七尿液淀粉酶活力测定（winslow）氏法
5.从第 10 管起依次迅速准确加入 0.1%淀粉液 2m1。迅速摇匀。置37℃，保温30分钟 。 6. 保温 30 分钟后，取出各管。向各管中加稀 碘液1-2滴摇匀。观察各管的颜色。各试管中 出现黄到蓝的色序。黄色表明无淀粉存在， 浅红色到紫色表明有淀粉的水解中间产物。 蓝色表明有淀粉或其初期水解产物存在。
尿液淀粉酶活力测定 （Winslow）氏法
实验目的：
掌握酶活力测定的一般思路与方法；
ห้องสมุดไป่ตู้理：
临床上通常用 Winslow 氏法测定尿或血清 中淀粉酶活性。该法对淀粉酶活性单位的 规定是：在 37℃， 30分钟，恰好能将0.1% 淀粉溶液 1m1 水解（指加入碘液后不再呈 兰色）的酶量定为一个活力单位。
【参考值】 （尿）8~64单位；（血清）4~32单位。 【注意事项】 1.试管干净。吸管专管专用。 2.尿液留取中段尿，结果准确。 3.判断试管颜色时要与第十管比较。
【临床意义】 胰腺炎、腮腺炎、胆道疾病时尿淀粉酶活性 增高。
血清及尿淀粉酶来自胰腺和唾液腺的分泌。在正常 情况下，大部分淀粉酶随消化液进入消化道，少量可进 入血液循环。引起血清淀粉酶活性增高有三个方面的原 因： ① 胰腺组织的炎症损伤使酶释放增加； ② 分泌过多； ③ 胰腺等组织排泄受阻。 由于淀粉酶分子量较小，易通过肾小球从尿排出， 所以，血清淀粉酶活性增高也反应在尿中。由此可知， 血和尿淀粉酶检查主要用于诊断胰腺炎。
试剂与器材：
1.0.9%NaC1； 2.0.1%淀粉； 3.0.3%碘溶液; 4.移液管； 5.试管； 6.恒温水溶锅。
操作：
1.留取尿液（中段尿） 2. 取 10 支 试 管 ， 按 次 序 记 上 号 码 ， 各 加 0.9% NaCl 1 m1。 3. 用 1m1 移液管加尿液 1m1 于第一管，使其与 0.9%NaC1混合。用移液管吸取，然后任其流出。 反复三次，使全管混匀。 4. 从第一管吸出 1m1 到第二管中，混匀。吸出 1m1 到第三管 …… 依次类推。到第九管混匀后 , 吸出 1m1 弃之。这样即可获得分别含有尿液 1/2 、 1/4 、 1/8……1/512m1 的不同浓度的尿稀释液， 第10管不加尿液作为对照管。
实验七探索影响淀粉酶活性的条件
实验七(2) 探索影响淀粉酶活性的条件执笔：审阅：审批：一．实验原理：淀粉遇碘后，形成色的复合物。
淀粉酶可以使淀粉逐步，它们遇碘后，不形成的复合物，但能够与斐林试剂发生氧化还原反应，生成砖红色的沉淀。
二．目的要求：1．初步学会探索影响的方法。
2．探索淀粉酶在水解的情况。
三．材料用具：质量分数为新鲜淀粉酶溶液，质量分数为淀粉溶液，质量分数为的盐酸，质量分数为的氢氧化钠溶液，热水，蒸馏水，冰块，碘液，斐林试剂。
四．方法步骤：（一）温度对酶活性的影响1．取3支洁净的试管，编上号，并且分别注入2mL 淀粉溶液。
2．将3支试管分别放入、沸水和中，维持各自的温度。
3．在3支试管中各注入1mL新鲜的溶液，摇匀后，维持。
4．在3支试管中各滴入1滴，然后摇匀。
5．观察这3支试管中溶液颜色的变化是。
（二）PH对酶活性的影响1．取3支洁净的试管，编上号，并且分别按下表中序号l至序号5的要求操作。
2．这3支试管，使试管内的液体混合均匀。
然后，将3支试管的下半部浸到的热水中，保温。
3．在3支试管中各加入2mL ，边加边试管，以便使试管内的物质。
4．将3支试管的放进盛有热水的大烧杯中，用酒精灯加热，煮沸。
5．观察这3支试管中溶液颜色的变化情况，观察结果。
结论：讨论：1．在温度对酶活性影响的实验中，为什么要在加入淀粉酶溶液之前控制好各自的温度?2．在pH对酶活性影响的实验中，能不能按照表格中序号1、5、2、3、4的步骤操作?为什么?例题解析：[例题1]为验证pH对唾液淀粉酶活性的影响，实验如下：1)操作步骤：①在1—5号试管中分别加入0．5％淀粉液2mL。
②加完淀粉液后，向各试管中加入相应的缓冲液3mL，使各试管中反应液的pH依次稳定在5.00、6.20、6.80、7.40、8.00。
③分别向1—5号试管中加入0．5％唾液1 mL，然后进行37℃恒温水浴。
④反应过程中，每隔1min从第3号试管中取出一滴反应液，滴在比色板上，加1滴碘液显色，待呈橙黄色时，立即取出5支试管，加碘液显色并比色，记录结果。
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实验七尿淀粉酶活性测定
淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的
a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。
血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和
唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾
液腺。
正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。
【目的】
1、验证淀粉酶的催化作用。
2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。
【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。
Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的
37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的
酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。
【器材】
试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。
【试剂】
1 、 9%NaCl
2、0.3%碘液
3、0.1%淀粉溶液
【操作】
1 、准备尿液（自备）。
2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。
3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液
体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。
吸出此混合液1ml 移入第二管中。
4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。
依此类推，如此继续稀释
至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。
第十管不加尿液作为对照管。
5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
往是实验成败的关键！）,置37C水浴中，确保 30分钟。
6、取出各管后，立即向各管中加入0.3%碘液 2滴，摇匀后观察各管的颜色。
*注：各管依次出现黄到蓝的色序，黄色表明无淀粉存在，浅红色紫色表明有淀粉的水解中间产物，兰色表明有淀粉存在。
【注意事项】
1、 1-10 号试管顺序勿搞乱。
2、加样速度尽量快。
【结果及计算】
应选择无蓝色管中尿稀释倍数最大的一管来计算。
假设无蓝色管中尿液稀释倍数最大的为第5管（而第六管为蓝色），已知在第5管内含尿液1/32ml,既1/32ml尿液能在37C、30 分钟水解 0.1%淀粉 2ml。
求出 1ml 尿液水解 0.1%淀粉 X ml。
1/32 ：2=1 ： x
x=2/1/32=2 X 32=64
即每 ml 尿液中所含淀粉酶的活性为64 单位。
【参考值】（尿）8〜64单位；（血清）4〜32单位。
【临床意义】
胰腺炎、腮腺炎、胆道疾病时尿淀粉酶活性增高。
【思考与分析】
通过本实验，你可以检验自己使用吸管的技术是否熟练、准确。
你的操作技术过关了吗？。