鸡传染性贫血免疫对肝微粒体抗氧化酶活性的影响

２４　中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第８期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

鸡传染性贫血免疫对肝微粒体抗氧化酶活性的影响　周　建　，孙素玲　（１．安徽农业大学，安徽合肥２３０００１；２．安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳２３３１００）　

摘要：目的是观察鸡传染性贫血多次免疫对肝微粒体中抗氧化酶活性的影响。对２Ｏ只ＳＰＦ鸡随机分为２组，每组１Ｏ　只，免疫组鸡用鸡传染性贫血弱毒苗免疫４次，每次间隔２周，对照组鸡注射同剂量的生理盐水。最后一次免疫后１０　ｄ取肝　脏制备微粒体，利用测试盒测定肝微粒体中的ＧＳＨ—Ｐｘ活性、ＳＯＤ活性、ＣＡＴ活性和ＭＤＡ含量。结果与对，Ｎ￣ｆｔ相比，免疫组　肝微粒体中ＧＳＨ—Ｐｘ活性、ＳＯＤ活性和ＣＡＴ活性都显著提高（Ｐ＜ｏ．０５），ＭＤＡ含量显著减低（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论为鸡传染性　贫血多次免疫可提高鸡体抗氧化能力。　关键词：鸡传染性贫血；免疫；肝微粒体；抗氧化酶活性　

中图分类号：￥８５２．２３　文献标识码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１１）０８—００２４—０２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｅｍｉａ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　

ＺＨＯＵ　Ｊｉａｎ　，ＳＵＮ　Ｓｕ—ｌｉｎｇ　（１．Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３０００１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ａｎｈｕｉ　Ｓｃｉｎｅｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ　２３３１００，Ｃｈｉｎａ）　

收稿１３期：２０１０—１２—２Ｏ　基金项目：安徽省教育厅重点项目“鸡传染性贫血胶体金快速诊　断试纸条的研制”（ＫＪ２００８Ａ３２ＺＣ）　作者简介：周建（１９８６一），女，助理兽医师，学士，研究方向为动物　疫病防控　通讯作者：孙素玲，Ｅ　ｍａｉｌ：ｓｓｌｌ９５７１０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ　

ｏ　＜）　（＞●＜＞●（＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜）●＜＞●（＞●＜＞●＜＞…　●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞　㈨●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●Ｃ＞●＜＞“Ⅵ　＜＞●（＞●＜＞●＜＞●０●＜＞●＜＞　＜）●　菌对庆大霉素和环丙沙星的耐药水平并未降低，说　明其耐药机制不由该质粒介导而是其他质粒或者染　色体介导；另外此质粒并不介导耐药性。　３．２抗菌药物必须通过大肠杆菌外膜才能进入细　菌细胞内发挥抗菌作用。ｏｍｐＣ与ｏｒｎｐＦ是大肠杆　菌的两个主要外膜蛋白［６］。文献报道缺失ｏｍｐＦ显　著提高对氟诺沙星、四环素、头孢菌素、先锋霉素和　头孢西丁的耐药性，缺失ｏｍｐＣ则增强对头孢菌素　和头孢西丁的耐药性。ｏｍｐＡ是大肠杆菌表达量最　大的主要外膜蛋白，同时也是孔蛋白，试验证明ｏｍ　ｐＡ形成的通道可以通过一些小分子溶质　］，缺失　ｏｍｐＡ的Ｅ．ｃｏｌｉ菌株可以提高对喹诺酮类药物的　ＭＩＣ［８］。因此这些外膜蛋白直接影响细胞外膜对抗　菌药物的渗透性及耐药性，表达量降低甚至不表达　就会导致多重耐药性的发生。本试验中，对１号和　２号大肠杆菌提取外膜蛋白，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析，　１号菌株缺少ｏｍｐＡ；２号菌株缺少ｏｍｐＦ和ｏｍｐＡ，　可见ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ的缺少是两株大肠杆菌多重耐药　的原因之一；经中药作用后，１号菌株ｏｍｐＡ恢复表　达；２号菌株ｏｍｐＦ恢复表达；但经过两菌株中药作　用前后对环丙沙星和庆大霉素的ＭＩＣ测定，其耐药　水平并没有变化，表明ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ的缺少并不是　大肠杆菌对环丙沙星和庆大霉素耐药的主要原因，　香芪口服液能够恢复大肠杆菌某些外膜蛋白的表　达，但不能恢复其对抗生素的敏感性。　

３．３本试验中，香芪口服液虽不能消除大肠杆菌　的耐药性，但通过对其消除大肠杆菌部分质粒以及　对外膜蛋白的恢复表达的研究，为今后耐药抑制剂　的研发提供理论基础，为国内外兽医临床、医学临　床解决日趋严重的耐药菌感染提供新理论、新方　法，同时为有效遏制人源性和动物源性细菌耐药性　的交互传播提供试验依据。　参考文献：　［１］　曾春兰，钟振国．中药抗菌作用的研究进展ＦＪ３．广西中医学院　学报，２００６，９（１）：５１－５３．　［２３　刘立新．中药消除细菌耐药性的研究进展［Ｊ］．畜牧兽医科技　信息，２００８（５）：１５　１６．　［３］雷连成，韩文瑜，段艳．大肠杆菌耐药性抑制剂作用机制的初　步研究［Ｊ］．中国兽药杂志，２００４，３８（２）：１８—２１．　［４］　邬苏晓，肖正中，周建超．中西药联用对猪大肠杆菌体外抗菌　活性分析［Ｊ］．甘肃畜牧兽医，２００９（１）：９　１１．　［５］ＣＬＳＩ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ；Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．ＣＬＳＩ　ｄｏｅｕ—　ｍｅｎｔ　ＭＩＯ０一Ｓ１９［ｓ］．Ｗａｙｎｅ，ＰＡ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００９：卜１３５．　［６］Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ　Ｅ，Ｗａｌｔｈｅｒｓ　Ｄ，Ｋｅｎｎｅｙ　Ｌ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＣｐｘＡ　ＣｐｘＲｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｒｉｎｓ　ＯｍｐＦ　ａｎｄ　ＯｍｐＣ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００５，　ｌ８７　１　５７２３－５７３１．　ｒ７］　Ｓｕｇａｗａｒａ　Ｅ，Ｎｉｋａｉｄｏ　Ｈ．Ｐｏｒｅ—ｆｏｒｍｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＯｍｐＡ　ｐｒｏ—　

ｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９２，２６７：２５０７—２５１１．　［８］　Ｃｈａｐｍａｎ　Ｊ　Ｓ，Ｇｅｏｒｇ。ｐａｐａｄａｋ０ｕ　Ｎ　Ｈ．Ｒｏｕｔｅｓ　ｏｆ　ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ　ｐｅｒ—　ｍｅａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，　１９８８，３２：４３８—４４２．　中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第８期　２５　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｅｍｉａ（ｃｈｉｃｋｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｅｍｉａ，ＣＩＡ）ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ，２０　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　Ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｉｔｈ　１０　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｅａｃｈ．Ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｖａｃ—　ｃｉｎａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＩＡ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　４　ｔｉｍｅｓ　ａｔ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｖａｌ　ｏｆ　２　ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｅｅｔｅｄ　ｂｙ　ＮＳ．Ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　１０　ｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｌａｓｔ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．ＧＳＨ—ＰＸ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，　ＳＯＤ　ａｃｔｉｖｉｔｖ，ＣＡＴ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ＭＤＡ　ｃｏｎｔｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｅｓｔ—ｂｏｘ．　Ｃｏｒｎ—　ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．ＧＳＨ—ＰＸ　ａｃｔｉｖｉｔｙ。ＳＯＤ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ＣＡＴ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｓｉｇｎｉｆｉ—　ｃａｎｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＭＤＡ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　１ｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ　ｗｒｅｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．Ｏ５）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＣＩＡ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｃｋｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｅｍｉａ；ｉｍｍｕｎｅ；ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＳＵＮ　Ｓｕ—ｌｉｎｇ　

鸡传染性贫血（ｃＩＡ）是一种鸡免疫抑制性传染　病。ＣＩＡ是由鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）感染引起　的，以再生障碍性贫血和淋巴器官萎缩为主要特征　的幼龄鸡的免疫抑制性传染病。ｃＩＡＶ导致鸡群的　死亡增加、存活率和体增重降低，因免疫器官损伤引　起严重的免疫抑制，降低鸡群对各种常规疫苗免疫　接种效果，增加鸡群对各种病原的易感性，引起继发　感染，给养鸡业带来很大的经济损失。由于ＣＩＡＶ　的传播已呈全球蔓延趋势，近几年的流行病学调查　表明，ＣＩＡＶ在我国鸡群中的感染非常普遍，感染　率高达４Ｏ　～９６　｛　，目前，还没有安全、有效、适　用的商品化ＣＩＡ疫苗可用，由于ＣＩＡＶ对理化因　子的抵抗力极强，依靠非免疫接种的综合防制措施，　难以对其传播进行有效控制。国内外关于ＣＩＡ活　疫苗免疫的研究文献不少，但未见ＣＩＡ活疫苗免疫　对鸡体抗氧化酶影响的文献，尤其是在亚细胞水平　上。为此，进行了此项试验，以观察ｃＩＡ免疫对肝　微粒体抗氧化功能的影响，为ＣＩＡ免疫的研究提供　参考。　１材料与方法　１．１　试验动物　２Ｏ只７Ｏ日龄ＳＰＦ自来航蛋鸡，安　徽科技学院ＳＰＦ动物房提供。　１．２　主要仪器及试剂　ＤＹ８９一Ｉ型电动玻璃匀浆　机，宁波新芝科器研究所；７２２型可见光分光光度　计，上海精密科分析仪器总公司制造；鸡传染性贫血　弱毒苗，德国罗曼动物保健有限公司，批号　８０３４８１１；卡介苗，上海生物制品研究所，批号　２００９０３１２０２；谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ—Ｐ　）测试　盒，南京建成生物工程研究所，批号２００９］　２１７；超氧　化物歧化酶（ＳＯＤ）测试盒，南京建成生物工程研究　所，批号２００９１０１３；丙二醛（ＭＤＡ）测试盒，南京建　成生物工程研究所，批号２００９０９０７；过氧化氢酶　（ＣＡＴ）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号　Ａ００５。　１．３试验动物的分组和鸡体免疫２Ｏ只ＳＰＦ鸡随　机分为２组，每组１０只，试验组首次免疫含福氏完　全佐剂的抗原乳剂２　ｍＬ／只，两侧胸部皮下分点注　射，以后每隔２周加强免疫１次，注射含福氏不完全　佐剂抗原乳剂１　ｍｌ　／只，共免疫４次；对照组注射同　剂量的生理盐水。　１．４肝微粒体的制备　最后一次免疫后１０　ｄ，鸡　停食不停水２４　ｈ，处死，放尽血液，迅速剖开腹腔取　出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用滤纸吸干肝　脏表面的水分。称重后置于烧杯中，用手术剪剪碎，　按每克肝脏３　ｍＬ的比例加入蔗糖Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲　液，用玻璃匀浆机制备匀浆，转速６００　ｒ／ｍｉｎ，研杵上　下移动８次，将匀浆液倒人量简中，用缓冲液洗涤匀　浆管并将其倒入量筒中，最后缓冲液加至约５　ｍＩ　／ｇ　组织，再以６　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｒａｉｎ，弃去沉淀部分　（细胞碎片和细胞核），取上清液以１２　０００　ｒ／ｒａｉｎ离　心１０　ｒａｉｎ，弃上清液，沉淀部分即为线粒体。量取　去除线粒体的上清液的总体积，加入ＣａＣ１。溶液２　ｍＬ，以１４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ，弃取上清液，沉　淀部分即为粉红色、半透明的微粒体。将微粒体沉　淀，混悬于ＫＣ１一Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液中，并用玻璃匀浆　器充分混均匀，再以１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１５　ｍｉｎ，其　沉淀即为经清洗的微粒体。最后将制备所获得的微　粒体悬混于ＫＣ１～Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液（缓冲液用量约为　ｌ　ｍＬ／ｇ组织）中，用玻璃匀浆器充分混合均匀，超声　波破膜后待用。使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白　的含量。　１．５肝微粒体中蛋白质含量测定（双缩脲法）ｆｉｓ３　取６支试管，分别加入０，０．２，０．４，０．６…０　８，１．０　ｍＬ　的标准酪蛋白质溶液，再分别加入０，０．２，０．４，０．６，　０．８，１．０　ｍＬ的蒸馏水，然后各加入４　ｍＩ　双缩脲试　剂，在室温下放置３０　ｍｉｎ，波长５４０　ｎｍ处，１　ｃｍ光　径比色杯，蒸馏水调零，比色。以酪蛋白的含量为　Ｙ，光密度为Ｘ，计算出回归方程一。　吸取１　ｍＬ微粒体样本，加入１．０　ｍＬ蒸馏水和