从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的简易方法

科技信息2009年第19期

SCIENCE&TECHNOLOGY INFORMATION

0．引言

随着生命科学技术的飞速发展，对生命奥秘的探索已经深入到分子水平，mRNA差异显示技术（mRNA differential display）[1]就是从分子水平分离差异表达基因（或片段）的最有效方法之一，而从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）中回收差异片段是mRNA差异显示技术的一个重要环节，虽然目前存在几种常用的回收方法[2-4]，也有几家知名生物试剂公司开发了相应的试剂盒，但对于应用差异显示技术这种需要大量回收DNA片段的方法来说，这些回收方法不是操作较繁琐就是回收成本较高，因此，探索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的实用方法就显得尤为重要。

1.材料与方法

1.1变性聚丙烯酰胺凝胶的制备

玻璃板的清洗、硅化处理、安装、灌胶、上样（每个胶孔的样品和上样量严格控制一致）、电泳等操作参照Sequi-Gen GT核酸电泳系统操作说明进行，变性聚丙烯酰胺凝胶的配制参照《分子克隆实验指南》（第三版）。

1.2聚丙烯酰胺凝胶银染显色

按照朱丹等报道的方法[5]略加改进。电泳后的凝胶（连同玻璃板）胶面朝上将放入瓷盘中，用10%的冰乙酸固定20分钟，去离子水洗三遍（每次约2分钟）；用1g/L的AgNO3，0.15%甲醛染色30分钟，再用去离子水洗三遍（每次约30秒），用30g/L的NaCO3，0.15%甲醛显影至条带清晰，用10%的冰乙酸定影。以上操作均在脱色摇床上进行以保证染色质量。

1.3从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段

1.3.1切胶

在凝胶尚未完全干燥时，选择三条大小在500bp左右，亮度一致的条带，用干净的手术刀片小心地从凝胶上切下预回收的DNA凝胶条，转移至事先称重的0.5mL的离心管中，称重；旋即用小号手术刀片侧面对着管壁将凝胶挤碎。

1.3.2回收

1.3.

2.1直接洗脱法

估算出凝胶条的大致体积，向离心管中加1~2倍体积的洗脱缓冲液或去离子水，置于95℃水浴中20分钟；以12000g离心2分钟后，将上清液（DNA粗回收液）移至一新离心管中，取一半DNA粗回收液用作PCR的模板（只需3μL），另一半用改进方法做进一步处理。

1.3.

2.2改进的直接洗脱法

在上步留下的一半DNA粗回收液中加入450μL无水乙醇，10μL 醋酸(3mol/L，pH7.0)，5μL糖原（70mg/mL），冰上放置30分钟，12000g/分钟离心10分钟；弃上清液，用70%乙醇漂洗DNA沉淀，经37℃烘干，用10μL水或TE缓冲液溶解，取3μL进行PCR扩增。

1.3.

2.3试剂盒回收法

向离心管中加入1~2倍体积的凝胶浸泡液PE，50℃水浴30分钟，液体转移至过滤柱CS中，12000g/分钟离心3分钟；弃掉过滤柱，将收集管中的溶液转移至新离心管中；向离心管中加入3-6体积的结合液PG，混匀；转移液体至吸附柱CAL内，以12000g/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，以12000g/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μL漂洗液PW，以12000g/分钟离心30秒，倒掉废液；将吸附柱放入50℃温箱中，使之彻底干燥，向吸附柱CAL吸附膜中央滴加适量预热至65~70℃的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，以2000g/分钟离心2分钟，用一新离心管收集DNA溶液，取3μL做模板用于PCR扩增。

1.4回收DNA的二次PCR

分别用上述三种方法回收的DNA溶液做模板，20μL反应体系，模板3μL，10mmol/L的dNTPs，1U的Taq酶，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒；42℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；最后72℃延伸5分钟。取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察。

2.结果与分析

从图1中可以看出，三种方法的

回收产物经二次PCR后，均获得了预

期大小（500bp左右）的扩增产物。其中

2号条带没有杂带，亮度最高，这说明

试剂盒回收法的纯度好、回收率最高；

同2号一样，3号泳道中也没有出现杂

带，这说明经乙醇沉淀纯化处理的回

收产物在纯度上已经可以与试剂盒法

相媲美，完全可以满足二次PCR扩增

的需要；而2号泳道出现“弥散”，在

500bp附近有一条微弱的主带，这说明

未做纯化处理的回收产物纯度不够，

可能存在某些影响PCR反应的物质。

3.讨论

从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸样

品是mRNA差异显示技术工作中经常

遇到的问题，在实验中起到承上启下

的关键作用，回收的成功率以及再扩

增时确保其与原序列的一致性是相当

重要的，虽然有试剂盒可供选用，但价

格较贵。从实验结果来看，直接洗脱法

结合乙醇沉淀纯化处理的凝胶回收方法虽然在回收率上低于试剂盒回收法，

但完全可以满足二次PCR扩增的需要。从经济的角度看，直接洗脱结合乙醇沉淀法可以用于大批量DNA差异条带的回收。

【参考文献】

［1］Liang P,Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science,1992,257（14）:967-971．

［2］王宏，李春海，陈高明等.mRNA差异显示技术中差异条带的回收与再扩增[J].中国肿瘤临床，1999，26（5）：350-351．

［3］李拥军，敖红，孙桂金.mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较[J].生物技术，2005，15（3）：43-44．

［4］李卫东，孟祥文，李伟等.一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶回收、克隆DNA的方法[J].中华医学遗传学杂志，1997，14:380-381．

［5］朱丹，王亮等，应用PCR-SSCP印染技术检测食管癌p53基因点突变.中华医学遗传学杂志，1994，11(6):354．

作者简介：高传军（1975—），男，安徽利辛人，黑龙江大学重点建设与发展工作处助教，主要从事实验教学和高等教育管理研究。

※黑龙江大学青年科学基金项目“甜菜M14花期特异表达基因遗传转化体系的建立”[项目编号：QL200644]。

［责任编辑：张慧］

一种从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的简易方法

高传军

（黑龙江大学黑龙江哈尔滨150080）

【摘要】从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段是分子生物学中的常用技术，本文在对目前几种常用回收方法作深入细致分析的基础上，通过设计对比实验找到一个既简单又经济、实用而有效的回收方法。

【关键词】聚丙烯酰胺凝胶；DNA回收

图1回收DNA片段二次

PCR扩增产物琼脂糖凝胶

电泳(1%)结果

M是DL2000的Marker；1直接

洗脱法；2试剂盒回收法；3改

进直接洗脱法。

科

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○本刊重稿○

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