医学免疫学检验-讨论问题参考答案

TRUST试验讨论问题参考答案

试验中VDRL抗原包含哪些成分各起什么作用

心磷脂：与反应素结合；卵磷脂：加强心磷脂的抗原性；胆固醇：增强抗原的敏感性。三者按适当比例配制的乙醇溶液。EDTA防止抗原变性（半年内），氯化胆碱灭活待检血清中补体。

2.什么是反应素，反应素是如何产生的其有什么免疫学特性

反应素为抗类脂质（心磷脂）抗原的抗体。由螺旋体本身释放的脂蛋白样物质和心磷脂或病损细胞释放的类脂诱导产生。非特异性抗体，具有广泛的交叉反应性，可与200多种抗原反应。

试验阳性，即患者血清中检出反应素就能诊断为梅毒吗为什么

TRUST试验阳性不能确诊为梅毒。TRUST试验检测的反应素为梅毒螺旋体非特异性抗体，除梅毒外，自身免疫病（SLE、RA、SS等）、恶性肿瘤、动静脉血栓、心血管病、妊娠、反复流产、疟疾、结核、麻风、HIV感染、其它性传播疾病、其它螺旋体感染、多种皮肤病、发热疾病、多次输血、新近免疫接种、静脉注射毒品者等有一定的阳性率（生物学假阳性），但反应素效价通常＜1:8，生物学假阳性反应中约2/3在6个月或更短时间内消失。反应素阳性需结合临床综合考虑才能作出诊断。一期梅毒初发时反应素阳性率70%～90%（很多患者初次测定反应素可能为阴性，间隔2周后再测定）；二期梅毒患者阳性率可达100%；晚期梅毒患者阳性率显著下降，为40%～95%。

试验阳性，为什么还要进一步做TPPA试验

TRUST试验检测的反应素为梅毒螺旋体的非特异性抗体，在低危人群筛查时假阳性率较高，故阳性结果需用密螺旋体抗体实验（如TPPA等）确认。

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ELISA检测HBsAg讨论问题参考答案

1.请从测定操作方面讨论ELISA试验结果的影响因素。

①标本采集与保存：溶血、长菌、贮存时间过长、血凝固不全、反复冻融等；②试剂准备：用前将试剂盒平衡至室温；③仪器设备：加样枪、酶标仪、洗板机、保温箱和温度计等性能、质量、校准和准确性；

④加血清标本及试剂：加到孔底，不可太快、溅出和产生气泡；⑤温育：温度和时间要准确、足够；⑥洗板：用试剂盒内配的洗涤液，洗涤液加满，洗涤次数和每次洗涤的浸泡时间要够，拍干；⑦显色：温度和时间要准确、足够；⑧终止反应：酶标仪比色，必须加终止剂，终止酶促反应和转换吸收峰；⑨结果判断：以试剂盒说明书为准；⑩酶标仪比色：最好用双波长法，并在仪器设定时不设空白。

2.双抗体夹心一步法检测HBsAg时，若样品中HBsAg浓度太高会发生什么后果为什么遇到此现象应如何处理

若样品中HBsAg浓度过高会发生钩状效应导致实验结果出现假阴性或假低值。

血清标本中HBsAg浓度太高，一部分HBsAg完全饱和固相抗HBs，反应液中剩余游离HBsAg与酶标抗HBs结合，导致固相抗HBs-HBsAg-酶标抗HBs复合物形成减少甚至未形成，洗涤时反应液中的HBsAg-酶标抗HBs复合物被洗掉，留在固相载体上的酶减少甚至没有，加入底物后，显色浅或不显色。

血清标本作1:1000稀释后再测定。

3.如何做ELISA试验的室内质控其目的是什么

每次实验应同时设置：已知含有待测物的阳性对照、不含有待测物的阴性对照、空白对照和弱阳性质控血清。阳性对照监测反应条件和试剂等，阴性对照监测非特异性吸附、洗涤等，空白对照监测底物是否变质，在无酶的条件下是否显色，弱阳性质控血清监测试验的检测下限。

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ANA试验讨论问题参考答案

1.什么是ANA目前临床上筛检ANA的最常用方法是什么

抗核抗体（ANA）是一组以真核细胞的各种核成分为靶抗原的自身抗体的总称。主要为IgG，也有IgM、

IgA和IgD，无器官和种属特异性。

目前临床上筛检ANA的最常用方法是间接免疫荧光法。

2.在固相膜免疫测定试验中，ANA检测对照线和HCG检测对照线各是如何形成的

ANA检测对照线：对照上包被的人IgG与胶体金标记的抗人IgG抗体结合，使大量胶体金颗粒聚集在对照线上，对照线出现红色。

HCG试验讨论问题参考答案

1.在固相膜免疫测定试验中，HCG检测对照线各是如何形成的

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HCG检测对照线：对照线上包被的抗鼠Ig抗体与金标单克隆抗体结合，使大量胶体金颗粒聚集在对照线上，对照线出现红色。

免疫印迹法检测ENA抗体试验讨论问题参考答案

1. 什么是ENAENA抗体谱包括哪些自身抗体ENA抗体的检测方法

ENA（extracable nuclear antigens，可提取性核抗原）为细胞核中可用盐水提取的一组靶抗原的总称。

ENA抗体谱包括抗Sm、抗核RNP、抗SS-A/Ro、抗SS-B/La、抗Jo-1、抗Scl-70等。

目前ENA抗体检测的最常用方法：免疫印迹法（IBT）。

2.免疫印迹法检测ENA抗体试验，酶标记什么物质，检测过程中其与什么物质反应ENA抗体检测对照线是如何形成的

酶标记抗人IgG的抗体。

酶标记抗人IgG的抗体与印迹膜条上ENA-抗ENA-IgG复合物（10分）中IgG Fc段特异结合。

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ENA抗体检测对照线：对照线上包被的人IgG与HRP标记的抗人IgG抗体结合，加入酶底物，酶催化底物反应生成不溶性有色产物，使印迹膜上对照线着色。

3.免疫印迹法检测ENA抗体试验，若免疫印迹膜洗涤不干净和反应槽内有液体残留，各会引起什么后果

印迹膜洗涤不干净，残留的血清IgG与后续加入的酶标抗人IgG抗体结合，或残留的酶标抗人IgG抗体，二者可导致非特异性显色，使膜条背景色加深。

反应槽内有液体残留，残留液中的血清IgG可与印迹膜条上ENA-抗ENA-IgG复合物中的IgG竞争结合后续加入的酶标抗人IgG，降低试验灵敏度；残留液中的酶标抗人IgG中的酶可催化底物显色，使膜条背景色加深，掩盖抗ENA抗体显色条带，干扰结果判断。

4.试分析反应温度和时间对免疫印迹法检测ENA抗体结果的影响

反应温度不够使抗原抗体反应速度和酶活性降低，反应时间不够使抗原抗体反应和酶催化底物显色反应不完全，实验敏感性降低，甚至导致假阴性。但反应温度过高降低抗原、抗体和酶的活性，同时会增加印迹膜非特异性吸附，导致非特异性显色，膜条背景色加深。反应时间过长也会增加印迹膜非特异性吸附。

5.免疫印迹试验，在显色前，为什么要将底物（显色剂）平衡至室温

显色反应是一种酶促反应，与反应温度和时间有关。如果底物刚从冰箱取出就参与酶促显色反应，反应温度只有4℃，会使显色弱而影响灵敏度。让底物溶液平衡至室温，使其温度接近37℃，以减少温度对酶催化底物显色反应的影响。

6.抗ENA抗体的临床意义

抗Sm：SLE的血清标志性抗体。对SLE的特异性为99%，敏感性为20%～40%。抗Sm阴性不能排除SLE。抗Sm抗体水平与SLE疾病的活动性和临床表现无相关性。对早期、不典型的SLE或治疗后的回顾性诊断具有很大帮助。

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抗RNP抗体：抗U1-RNP抗体。高效价抗RNP抗体是诊断MCTD的重要血清学依据，阳性率＞95%。但无疾病特异性，其它AID也可检出：SLE 30%～40%，SS 20%、RA 15%～50%、进行性系统性硬皮病（PSS）10%～15%、皮肌炎（DM）/多发性肌炎（PM）10%。

SS-A/Ro抗体和SS-B/La抗体：SS患者中最常见的自身抗体，二者的阳性率均为40%～95%，一般同时出现。SS-A抗体在SLE、新生儿狼疮、RA、原发性胆汁性肝硬化（PBC）中的检出率分别为20%～60%、100%、3%～10%、20%。SS-B抗体对SS的特异性高于SS-A抗体(可达50%～60%)，SS的标志性抗体，SLE中阳性率为10%～20%。

抗Jo-1抗体：最常见于PM，为PM标志性抗体。在PM、PM/DM、单独DM、硬皮病中的检出率分别为40%～50%、25%、＜10%、2%～5%。

抗Scl-70抗体：特异性地出现于PSS病人，阳性率为25%～70%。局限性硬皮病为阴性。

实验原理

检测HBsAg的原理

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在微孔上包被纯化乙肝表面抗体（抗HBs）（5分），加入待检血清和酶标抗HBs(抗HBs-HRP) ，血清中HBsAg与微孔上的抗HBs和酶标抗HBs结合（5分），洗涤分离后（5分），加入酶底物系统进行显色反应（5分）。显色为阳性，不显色为阴性（5分）。

检测AFP的原理

在微粒上包被纯化AFP抗体（5分），加入待检血清和ALP标记的AFP抗体，血清中AFP与微粒上的AFP抗体和ALP标记的AFP抗体结合（5分），洗涤分离后（5分），加入ALP底物，ALP催化底物进行化学发光反应（5分）。发光强度与血清中AFP浓度呈正相关（5分）。

实验原理

将VDRL 抗原致敏的甲苯胺红颗粒与待检血清混合（5分），若待测血清中存在反应素（5分），其与甲苯胺红颗粒表面VDRL 抗原结合（5分），使甲苯胺红颗粒凝集（5分），出现粉红色凝块（5分）。

4.金免疫层析实验检测HCG的原理

金标记的抗HCGαMcAb干片粘贴在近下端，抗HCGβ单克隆抗体和抗小鼠IgG抗体分别固定在NC膜反应区的检测线和对照线上（5分）。当试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体，液体向上端移动，流经金标抗HCGαMcAb干片时使其复溶，若标本中有HCG，可与金标抗HCGαMcAb结合（5分）。此抗原抗体复合物移动至检测线时即被固相抗HCGβ所捕获（5分），在膜上显出红色检测线（5分）。过剩的金标抗HCGαMcAb继续前行，至对照线与固相抗小鼠IgG结合，出现红色对照线（5分）。

5.免疫印迹法检测ENA抗体的原理

先将ENA进行SDS-PAGE，使混合ENA多肽抗原按分子量大小分离为不同区带，然后转移至NC膜上，制成ENA印迹膜条（5分）。让ENA印迹膜条与稀释后的患者血清共同温育进行第一步反应，如标本中含有ENA抗体，则该抗体（IgG）与印迹膜上相应ENA特异结合（5分）。为检测结合的抗体，用酶标记抗人IgG进行第二次温育反应（5分），最后加入酶底物，酶催化底物进行氧化还原反应生成不溶性有色产物，使印迹在膜上的抗原条带着色（5分）。根据膜上显色区带的位置，对照ENA抗体标准图谱，判断有无某种抗ENA抗体（5分）。

6.间接免疫荧光法检测ANA的原理

固定在生物薄片反应区上的Hep-2细胞核抗原与稀释后的患者血清（第一抗体）温育反应（5分），如血清中含有ANA，其与细胞核成分特异结合（5分）。洗涤分离后（3分），加入荧光素标记的抗人IgG

与结合在核抗原上的ANA-IgG Fc段特异性反应（5分），洗涤分离后（2分），在荧光显微镜下观察，细胞核显示亮绿色特异荧光为ANA阳性（5分）。

7.金免疫渗滤试验检测ANA的原理

以Hep-2细胞核匀浆提取物作为核抗原（5分），将其固定在硝酸纤维（NC）膜上（5分）。加上待测血清，若血清中有抗核抗体（ANA），则ANA与NC膜上Hep-2细胞核抗原特异性结合，形成抗原抗体复合物（5分）。再加上胶体金标记的抗人IgG抗体与核抗原-ANA IgG Fc段结合（5分），使大量胶体金颗粒聚集而在膜上呈现出红色红色园斑（5分）。