油菜籽中转基因成份定性PCR检测方法编制说明

油菜中转基因成分检测 普通PCR 和实时荧光PCR 方法 编制说明

标准草案名称

中文

油菜中转基因成分检测 普通PCR 和实时荧光PCR 方法

英文

Detection of Genetically Modified Ingredients in Rapeseeds Conventional and Real-time PCR Methods 与国际标准和国外先进标准一致程度情况

等同 修改 非等效

标准号

/

英文名称 / 中文名称 /

任务来源

批准立项

的文件名

称和文件

号 关于下达2011年出入境检验检疫

行业标准复审修订计划项目的通

知

计划编号 2011B474r

制（修）订情况 制订

修订

替代的标准编号 SN/T 1197-2003

起止时间

起草单位 中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院

起草人 潘良文、李 想、黄 新、吕 蓉、杨捷琳、刘月明、高 琴。

专业类别

1、食品（化妆品）检验；

2、卫生检疫；

3、动物检疫；

4、植物检疫；

5、纺织产品检验；

6、轻工产品检验；

7、机电产品检验；

8、化工、矿产品和金属材料检验；

9、管理；10、鉴定；11包装及危险化学品

标准体系表代码

调整情况

本标准与SN/T 1197-2003相比，主要修改如下： ——修改了标准的中文名称和英文名称； ——增加了实时荧光PCR 检测方法； ——增加了品系特异性检测方法。

2 背景情况

目的、意义

油菜是一种重要的油料作物，每年我国要进口300-500万吨油菜籽和菜粕，主要来自加拿大、欧盟、澳大利亚、印度等国家。其中来自加拿大的油菜籽绝大多数为转基因油菜籽。自2002年起我国农业部相继对7种转基因油菜品系颁发了安全证书，包括MS1×RF1，MS8×RF3，MS1×RF2，Oxy235，RT73，T45和Topas19/2。这些转基因油菜品系转入的外源基因和调控元件多种多样，在口岸对转基因油菜籽和菜粕实施检测过程中，没有针对各转基因油菜品系的品系特异性检测方法，给检测工作带来极大不便。另外，在对进口的油菜籽和菜粕是否含有转基因成分的鉴定中，若初检发现外源基因的存在，则需进一步对具体的转基因油菜品系进行鉴定。

现有的检验检疫行业标准《油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法》中只规定了筛选检测和基因特异性检测的方法，已不能满足口岸实际检测的需要。进口的转基因油菜籽多为多种转基因油菜品系的混合，因此我国的现有标准不能满足口岸油菜籽转基因成分检测的需要，急需对现有检验检疫行业标准SN/T 1197- 2003 《油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法》进行修订和补充。

与国内外相关标准、文献的关系

本项目将对现有行业标准SN/T 1197-2003 油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法进行修订，以补充基于7种转基因油菜MS1RF1，MS8RF3，MS1RF2，Oxy235，RT73，T45和Topas19/2品系特异性序列的普通PCR和实时荧光PCR检测体系和方法。

国家标准GB/T 附录D和GB/T 附录G中对转基因油菜GT73结构特异性检测方法进行了简要描述。但两个国家标准中均仅涉及GT73品系，而且实时荧光检测体系不涉及品系特异性检测，而进口的转基因油菜籽多为多种转基因油菜品系的混合，且品系特异性检测方法特异性更强。因此我国的现有标准不能满足口岸油菜籽转基因成分检测的需要。

3 编制过程

准备阶段（可选项）1 资料查阅

在课题开始立项前，上海出入境检验检疫局就查阅了大量的国外和国内资料数十篇，并对国外权威网站进行检索。我们对现有转基因油菜品系进行了汇总，并对其含有的外源基因等情况进行总结和分析，同时也对现有检测方法和体系进行汇总和分析。

2 样品收集

我们对国外目前已经批准商业化的转基因油菜品系样品进行了收集和购置。

分工情况

根据任务下达要求，上海出入境检验检疫局负责中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《油菜中转基因成分检测普通PCR和实时荧光PCR方法》的修订工作。

标准草案编写情况

本标准草案是按照GB/T 《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写的。在任务下达的期限内，上海出入境检验检疫局相关技术人员积极查阅资料、收集样品和方法验证，对转基因油菜筛选检测、基因特异性检测和品系特异性检测普通PCR和实时荧光PCR方法进行了优化、筛选和验证，同时邀请5家单位进行了鉴定。在以上研究、验证和鉴定的基础上，2013年9月完成了标准草案的修订编写工作。

征求意见情况（适用于送审稿）

审定情况

（适用于报批稿）

预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）技术指标：经测试，标准中采用普通PCR方法进行检测，检测下限（LOD）均可达到％；采用实时荧光PCR方法进行检测，检测下限（LOD）均可达到％，可满足日常检测要求。

4 主要技术内容的确定

1、转基因油菜检测方法的汇总和筛查

5 验证情况（适用于方法类标准）

验证单位情况

验证单位验证人员验证时间福建检验检疫局陈文炳2013年10月湖南检验检疫局朱金国2013年10月山东检验检疫局高宏伟2013年10月烟台检验检疫局粟志平2013年10月上海交通大学杨立桃2013年10月

验证过程

邀请国内5家相关检测实验室，按照上海出入境检验检疫局提供的引物、探针、试剂、实验材料和实验方法对转基因油菜普通PCR和实时荧光PCR方法进行验证，主要包括对方法的特异性和灵敏度的测试。5家实验室包括福建湖南、山东、烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心和上海交通大学生命科学技术学院。

1、方法的特异性鉴定：

验证转基因油菜普通PCR和实时荧光PCR检测各片段（筛选、基因特异性和品系特异性）检测方法的特异性。

2、灵敏度鉴定：

将特定转基因品系标准品加入到非转基因或其它品系中制成含有%、%和%转基因成分的样品，提取DNA，进行灵敏度检测。

验证数据分析1、特异性测试结果分析：

1）、对油菜内源基因的检测，阳性结果只出现在油菜来源样品中，其它转基因作物品系和非转基因作物样品均呈阴性。

2）、对筛选和基因特异性外源基因的检测，阳性结果只出现在含有该基因的对应转基因油菜品系中，其它不含有该基因和非转基因作物样品均为阴性。

3）、对转基因油菜品系特异性的检测，阳性结果仅出现在以对应转基因油菜品系为模板的扩增中，其它转基因作物品系和非转基因作物无扩增条带或扩增曲线。

实验说明标准中所列转基因油菜相关检测方法特异性强。

2、灵敏度测试结果分析：

采用普通PCR扩增，标准中所列转基因油菜筛选、基因特异性和品系特异性检测方法的检测下限均可达％（w/w），实时荧光PCR扩增上述片段的检测下限均可达％（w/w）。

验证评价

上海出入境检验检疫局修订的油菜中转基因成分检测特异性强，灵敏度高，能准确检测对样品中转基因油菜成分进行定性检测和分析。