亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法编制说明
【检验】植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法编制说明
对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通PCR或实时荧光PCR，特异性扩增上述品系特异性片段，根据PCR扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪（些）种转基因油菜品系成分。
2.2与国内外相关标准、文献的关系
引用国际国内已发布的权威标准方法，属于标准等同采用。
3编制过程
3.1准备阶段（可选项）
3.2分工情况
中国检科院负责标准总体方案设计及标准草案，山东出入境检验检疫局负责转基因产品通用元件检测方法的收集，上海出入境检验检疫局负责转基因品系检测方法的收集，分工协作，保证了该标准的顺利完成。
CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。
dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。
dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。
dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。
SDS：sod
Taq：TaqDNApolymerase，DNA聚合酶。
TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液。
tNOS：terminator of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
实时荧光PCR定性检测
实时荧光PCR定性检测1．引物和探针大豆及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列。
2．实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表11—16，反应体系中各试剂的用量，可按照详细状况或不同的反应总体积举行适当的调节。
每个反应体系应设置两个平行测试。
3．实时荧光反应参数实时荧光定量PCR的反应参数为：37℃，5min；预变性，95℃，3min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
不同仪器可按照仪器要求将反应参数作适当调节。
4．实时荧光．PCR结果分析 (1)阈值设定实时荧光PCR反应结束后，应设置荧光信号阈值，普通挑选3～15个循环的阴性对比的10倍标准差作为阈值。
阈值设定原则按照仪器噪声状况举行调节，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
(2)实时荧光PCR定性检验的质量控制空白对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值大于或等于40。
阴性对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20～30。
阳性对比：外源基因检测Ct值小于或等于34。
上述指标有一项不符合者，应重新做实时荧光PCR扩增。
(3)实时荧光PCR结果判定测试样品外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品未检出转基因成分。
测试样品外源基因检测Ct值小于或等于36．内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品检出转基因成分。
测试样外源基因检测Ct值在36～40，应重做实时荧光PCR。
再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品检出转基因成分。
再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品未检出转基因成分。
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实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用
粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 2 期
除草剂基因 EPSPS 或抗虫基因 CrylA （ b ） 等转基因 成分， 以确定是否为转基因作物。 目前， 中华人民共和国农业行业标准和中华人 民共和国出入境检验检疫行业标准中已公示相关转 便于粮 基因作物所需检测的内源基因和外源基因 ， 油质检机构借鉴并开展转基因项目的检测工作 。实 时荧光定量 PCR 自建立以来， 发展非常迅速。 已用 于食品卫生检测领域。 随着实时荧光定量 PCR 的 不断完善， 该技术将在粮油质量安全领域得到更广 泛的应用。
收稿日期： 2012 － 05 － 16 1984 年出生， 作者简介： 许安君， 男， 江苏镇江人， 质检主管．
统的定性 PCR （ 聚合酶链式反应 ） 因其在转基因检 测中的高敏感性差易造成假阳性现象， 以及操作误 差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象 ， 使其已 经不能符合当前检测的要求。 随着技术的发展， 实 实时荧光定 时荧光定量 PCR 技术的研发不断成熟， 而且 量 PCR 技术不仅实现了对 DNA 模板的定量， 具有灵敏度高、 特异性和可靠性更强、 能实现多重反 应、 自动化程度高、 无污染性、 具有实时性和准确性 等特点。
［3 ］ ［2］ ［2］
，
对未知模板进行定量分析的
紫外灯， 灯与地面距离不宜超过 2． 0 ± 0． 1 m。 （ 2 ） 实验室工作区域的设置和要求 （ a） 试剂制备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、 试剂的分装和主反应混合液的制备 。试剂原材料必 须贮存在本区内， 并在本区内制备成所需的贮存试 本区并没有严格的要求。 剂。对与气流压力的控制， （ b） 样品处理区 该区域主要进行的操作为样品核酸提取 、 贮存， 扩增混合液制备。 本区的压力梯度要求为： 相对于 邻近区域为正压， 以避免从邻近区进入本区的气溶 由于在加样操作中可能会发生气溶 胶污染。另外， 瑩 瑔
转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书
转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书试剂盒简介货为了适应新加坡石斑鱼虹彩病毒染料法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照 OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。
应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
试剂盒组成及试剂配制：酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。
3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶4.生物su标记抗体稀释液（Biotinantibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRPavidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物su标记抗体（Biotinantibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRPavidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
样本处理及要求：1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
转基因成分PCR定性检测技术ppt课件
转基因成分PCR定性检测技术
转基因成分PCR定性检测技术
• 电泳及分析
1、琼脂糖凝胶电泳 2、结果分析 3、异常情况分析
转基因成分PCR定性检测技术
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯 化和鉴定核酸的方法。 1）琼脂糖：
根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点 琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持 液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性 DNA的快速连接等。
Terminator
转基因作物现状
• 转基因作物现状
转基因作物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例 转基因植物在美国问世，1987被允许进入田间鉴定试验，1992年开始 大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年在美国最早开始 商业化生产，当年种植面积174万公顷。
据“农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）”2011年3月7日发 布的年度报告称：2010年，共有29个国家种植了1.48亿公顷转基因作 物；1996年到2010年，全球转基因作物累计种植面积超过10亿公顷。
转基因成分PCR定性检测技术
2）凝胶浓度选择：
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5～60 1～20
0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
转基因成分PCR定性检测技术
3）电泳缓冲液
•转基因生物
是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是 通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。 简称：GMOs
食品中转基因成分的检测方法与限量标准研究
食品中转基因成分的检测方法与限量标准研究引言：随着人们对食品安全的关注度不断提高，转基因食品备受争议。
为了保护消费者权益，监管部门一直致力于开发食品中转基因成分的检测方法，并制定相应的限量标准。
本文将对现有的检测方法及限量标准进行研究。
一、食品中转基因成分检测方法1. PCR检测方法PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的检测转基因成分的方法。
通过匹配转基因重要基因的DNA序列，PCR可以检测到极低浓度的转基因成分。
然而，由于PCR方法对样品的处理过程较为繁琐，且存在较高的假阳性率，因此在实际应用中需要进一步改进。
2. 实时荧光PCR检测方法实时荧光PCR是基于PCR技术的一种改进方法。
它可以实时监测PCR过程中的荧光信号，准确判断转基因成分的存在与否。
相比传统PCR方法，实时荧光PCR具有高灵敏度和高特异性的优势，然而其设备和试剂的成本较高，限制了其在实际应用中的推广。
3. 基因测序方法基因测序方法是一种直接检测转基因成分的手段。
通过对食品中所有DNA序列的测序，可以准确判断是否存在转基因成分。
基因测序方法在理论上能够提供最准确的结果，但由于其高昂的费用和时间成本，目前在大规模应用中还存在一定的困难。
二、食品中转基因成分的限量标准1. 限量标准的制定依据食品中转基因成分的限量标准制定依据包括食品安全评估、转基因成分检测方法的可行性和社会公众意见等。
在制定限量标准时，应综合考虑科学研究和实际情况，确保转基因食品不会对人体健康产生不良影响。
2. 不同国家的限量标准差异不同国家对转基因成分的限量标准存在一定的差异。
例如，欧盟规定，食品中转基因成分的含量超过0.9%时，必须标示出来。
而美国则没有明确的限量标准，而是采取了一种“合理衡量”的方式，需要食品生产者自行决定是否标识转基因成分。
3. 限量标准的争议与改进转基因食品的限量标准一直备受争议。
一方面，部分人认为限量标准过于宽松，难以真正保护消费者权益；另一方面，也有人认为限量标准过于严苛，对农业发展造成不利影响。
实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用_敖金霞
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法(三)
食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法（三）实时荧光PCR反应体系见表2。
表2 实时荧光 PCR反应体系 7.5.2 实时荧光PCR反应参数实时荧光PCR反应参数见表3。
用法不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调节。
表3 实时荧光PCR反应参数 7.5.3 仪器检测通道的挑选设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标志的报告基团全都。
详细设置办法可参照仪器用法解释书。
7.6 结果分析、推断和表述 7.6.1 基线和闭值的设置实时荧光PCR反应结束并分析结果时，应设置基线和闽值。
基线范围设置在3个～15个循环。
基线闭值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对比扩增曲线最高点且Ct=40，通常状况下可以采纳仪器默认的基线阂值，即采纳3个～15个循环的阴性目标DNA对比的10倍标准差作为阈值。
7.6.2 质量控制7.6.2.1 平行样品的设置每个样品举行实时荧光PCR检测时应设置起码2个平行。
7.6.2.2 对比设置实时荧光PCR检测过程中应设置PCR 扩增试剂对比、PCR扩增阴性目标DNA对比、PCR扩增阳性目标DNA对比，并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空白对比同时举行实时荧光PCR检测，详细方式根据GB/T 19495.2中相关规定。
试验中设置的各种对比PCR检测结果应符合7.6.2.3～7.6.2.5。
否则，任一种对比假如浮现非下述正常结果，应重做试验。
7.6.2.3 核酸提取空白对比和PCR扩增试剂空白对比外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果Ct≥40。
7.6.2.4 PCR扩增阴性目标DNA对比外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果20≤Ct≤36。
7.6.2.5 PCR扩增阳性目标DNA对比外源基因检测结果Ct≤36。
7.7 结果推断和表述7.7.1 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≥40，内源基因检测20≤Ct≤36并浮现典型的扩增曲线，同时各种试验对比结果正常，此时可以判定该样品未检出xxx基因，结果表述为未检出xxx基因。
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《亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法》
编制说明
一、任务来源
根据国家认证认可监督管理委员会2010年下达的标准编写任务通知(计划编号：2010B323k)，由辽宁出入境检验检疫局主持制定。
二、意义
亚麻籽是世界上重要的油料作物之一，富含多量不饱和，这些脂肪酸可以加速，提高能力，分解，平衡血压，以及压抑制和增长等多种功效。
以、、和为主的西方，对亚麻子作为功能的研究和开发作了大量的工作，亚麻籽也作为辅料添加在谷物早餐、面包、混合坚果和快餐食品中。
1996年加拿大萨克斯其万大学培育了一种具有抗除草剂性状的转基因亚麻籽FP967品系，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。
后来被除名并规定永久不得商业化耕种，FP967品系转基因亚麻籽可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。
2009年，非法转基因亚麻籽在欧洲23国以及韩国、斯里兰卡、新加坡、泰国等28个国家发现，谷物、面包等产品若发现受污染都会下架。
面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因亚麻籽进行检测具有重要的现实意义。
三、制标依据和研究过程
本标准的编制工作引用和参考了GB/《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求进行编写。
此外，参考了国内外相关文献，主要有：
1. GB/T 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则
2. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
标准研制过程中，在方法的特异性、灵敏度等方面做了大量实验，并对所建立的标准方法进行了应用研究。
本标准经过验证实验，证明切实可行。
本标准检验方法是在以上研究、验证和鉴定的基础上进行起草的。
四、FP967品系转基因亚麻籽品系介绍和检测引物的来源
1. FP967品系转基因亚麻籽
FP967品系转基因亚麻籽，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。
由加拿大萨克斯其万大学所培
育，后来被除名并规定永久不得商业化耕种的亚麻品种，可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。
2．检测引物的来源
FP967品系转基因亚麻籽通过农杆菌介导转化获得，具有抗除草剂性状。
其中als基因源自抗氯乙酰胺的拟南芥品系；neo基因源自K12且受农秆菌nos启动子调控；nos基因源自农秆菌且受农秆菌nos启动子的调控；bla基因受细菌启动子的调控。
FP967品系转基因亚麻籽的检测引物来源于 NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
五、FP967品系转基因亚麻籽检测引物和探针的试验结果
1. 阳性参照
采用质粒合成的方法，合成了一个同时包含77bp SAD基因和95bp NOST-Spec基因的质粒“FlaxGM”。
两个片段同时出现在同一拷贝中。
这一质粒同时用于检测内参基因SAD和GM目标基因NOST-Spec的扩增效果。
2. 实时PCR特异性与灵敏度检测结果
内源基因检测引物和探针的实用性
采用SAD (内源基因) 检测引物和探针，选取亚麻籽、小麦、大麦、大米、油菜籽、大豆、玉米、棉花等8种样品，验证亚麻籽内源检测引物和探针的特异性，并验证上述8种样品DNA提取的质量。
检测结果如图1所示。
由图1可见，本标准中SAD(内源基因) 检测引物和探针适合于对亚麻籽内源基因的检测。
图1 内源基因SAD检测引物和探针的实用性检测结果
检测引物和探针的实用性
采用NOST-Spec检测引物和探针，选取转基因亚麻籽FP967合成质粒、非转基因亚麻籽、玉米DBT418、Bt176、Bt11、GA21、DLL25、CBH351、T14、MON810、NK603、TC1507、MON863、59122、MON88017、MIR604、大豆Mon40-3-2、Monday9788、油菜籽MonGT73、HCN92、Oxy-235、Laureate23-198、MS8ⅹRF3、MS1ⅹRF1、MS1ⅹRF2、T45、棉花Mon1445、Mon531、BXN、马铃薯RBMT21-129、紫花苜蓿J101、J163、夏南瓜ZW20等33种样品，验证上述检测引物和探针的实用性。
每对引物和探针重复检测两次，检测结果如图2所示，只有FP967品系转基因亚麻籽合成质粒出现了很好的阳性增幅曲线。
其余物种样品，包括非转基因亚麻籽样品均未出现扩增曲线。
结果表明：上述检测引物和探针适合于对FP967品系转基因亚麻籽NOST-Spec基因的检测。
图2 NOST-Spec测引物和探针的实用性检测结果
实时PCR灵敏度检测结果
对FP967阳性样品的灵敏度检测结果
将合成质粒FlaxGM稀释至40拷贝/反应、20拷贝/反应、10拷贝/反应、5拷贝/反应，每个稀释度重复10次。
验证上述检测引物和探针的灵敏性。
检测结果如图所示。
由图3可见，实时PCR检测FP967阳性样品的灵敏度可以达到>5拷贝/反应。
图3 灵敏度测试结果
七、标准征求意见情况
本标准从认监委标准化管理系统中发出15家单位征求意见，有？？？家单位反馈了意见。
所有意见全部接受，并按照意见进行了修改。
八、标准验证情况
本标准由3家单位：深圳出入境检验检疫局、吉林出入境检验检疫局、黑龙江出入境检验检疫局，针对标准的内容进行了验证试验。
结果表明：该方法可实现对FP967品系转基因亚麻籽成分的定性检测。
参考文献
1. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.。