三聚氰胺的应用现状及检测方法探讨
目录
摘要 (1)
Abstract (1)
前言 (1)
1 三聚氰胺基本概念 (2)
2 三聚氰胺用途与消费 (3)
3 用三聚氰胺制假蛋白原因及原理 (5)
4 食物中三聚氰胺的检测方法 (6)
5 造假产品的危害及纯蛋白检测方法 (13)
6 结语 (16)
参考文献 (16)
食品中三聚氰胺的检测方法探讨
摘要：三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，最主要是作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。三聚氰胺因其高含氮量被一些造假者利用添加在食品中,对人体健康造成危害。本文对三聚氰胺进行概括性介绍，并对国内外食品中三聚氰胺的检测方法进行综述和概括。
关键词：食品；三聚氰胺；检测方法
Abstract:Melamine is one of the nitrogen-containing heterocyclic triazinecompounds. Its main purpose is used as raw material for production of melamine formaldehyde resin (MF). It can be also used as flame retardant, superplasticizer and formaldehyde cleaner,etc. However,due to there are loopholes in the Kjeldahl method,melamine is added into foods to increase the nitrogen content by some counterfeiters. Therefore,this thesis descripted melamine generally,and arranged some detections of melamine in foods.
Keywords: Food ; Melamine ; Detection
前言
三聚氰胺（Melamine）（化学式：C
3H
6
N
6
），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-
三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类、对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。然而，近日青海、甘肃、吉林等省再现三聚氰胺超标奶粉，超标500余倍。很可能是对尚未完全销毁的“三鹿问题奶粉”进行加工、销售。
2000年代，因为我国经济的迅速发展，乳制品市场转变成一个很大市场，且因巨大消费群体，更可划分为高、中、低三个消费层次。为了调节大陆市场供应与需求，除了从海外的日本、新西兰等国进口将近30万吨乳制品以应付高中消费层次外，中国大陆绝大多数消费群体，包括婴幼儿，还是以我国自主生产的产品为主。
在此因素下，知名三鹿牌顺势推出以一袋18元人民币（约3美金），不到进口奶粉价格一半价格婴幼儿配方奶粉以应付大规模的奶业市场，之后并成为
大陆重要且知名婴幼儿奶粉品牌，多年蝉联该中国大陆自制乳品市场的首位。不过因为需求甚殷，价格竞争等因素，公司与政府均漠视生产流程及质量控管，终于爆发此弊端漏洞。
基于当前的社会背景和生活环境，市场上有可能仍然存在着以次充好的的不合格三聚氰胺超标食品。食品安全是国家与社会的基本安全，因此关注和严格监督食品安全十分重要。
本文首先概述三聚氰胺的基本性质及用途，然后分析造假原因，接着主要从化学的角度较详细来阐述各种常用的检测方法和反应机理，最后总结全文，指出造假产品的危害和更全面的蛋白质检测方法，并对此做出反思与总结。
1 三聚氰胺基本概念
1.1 三聚氰胺基本性质
三聚氰胺（英文名：Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫 2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。
化学式（分子式） C
3H
6
N
6
相对分子质量 126.15
CAS 登录号 108-78-1
EINECS 登录号 203-615-4
三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，不可燃，无味，低毒，密度 1.573g/cm3 (16℃)。常压熔点354℃，急剧加热则分解；快速加热升华，升华温度300℃。在水中溶解度随温度升高而增大,在20℃时，约为3.3 g/L，即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。
三聚氰胺呈弱碱性（pH值=8），与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中（pH值5.5～6.5）与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸[1]。
1.2 三聚氰胺合成工艺
三聚氰胺最早被李比希于1834年合成，早期合成使用双氰胺法：由电石（CaC
2
）
制备氰胺化钙（CaCN
2
），氰胺化钙水解后二聚生成双氰胺（dicyandiamide），再加热分解制备三聚氰胺。目前因为电石的高成本，双氰胺法已被淘汰。与该法相比，尿素法成本低，目前较多采用。尿素以氨气为载体，硅胶为催化剂，在380-400℃温度下沸腾反应，先分解生成氰酸，并进一步缩合生成三聚氰胺。反应式为：
6CO(NH
2)
2
== C
3
H
6
N
6
+ 6NH
3
↑ + 3CO
2
↑
生成的三聚胺气体经冷却捕集后得粗品，然后经溶解，除去杂质，重结晶得成品。尿素法生产三聚氰胺每吨产品消耗尿素约3800kg、液氨500kg。
按照反应条件不同，三聚氰胺合成工艺又可分为高压法(7-10MPa，370-450℃，液相)、低压法(0.5-1MPa，380-440℃，液相)和常压法(<0.3MPa，390℃，气相)三类。
国外三聚氰胺生产工艺大多以技术开发公司命名，如德国巴斯夫(BASF Process)、奥地利林茨化学法(Chemical Linz Process)、鲁奇法(Lurgi Process)、美国联合信号化学公司化学法(Allied Signal Chemical)、日本新日产法(Nissan Process)、荷兰斯塔米卡邦法(即DSM法)等。这些生产工艺按合成压力不同，可基本划分为高压法、低压法和常压法三种工艺。目前世界上技术先进、竞争力较强的主要有日本新日产Nissan法和意大利Allied-Eurotechnica的高压法，荷兰DSM低压法和德国BASF的常压法[2]。
中国三聚氰胺生产企业多采用半干式常压法工艺，该方法是以尿素为原料0.1MPa以下，390℃左右时，以硅胶做催化剂合成三聚氰胺，并使三聚氰胺在凝华器中结晶，粗品经溶解、过滤、结晶后制成成品。
2 三聚氰胺用途与消费
2.1 三聚氰胺主要用途
三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。
其主要用途有以下几方面：
（1）装饰面板：三聚氰胺板，全称是三聚氰胺浸渍胶膜纸饰面人造板，是将带有不同颜色或纹理的纸放入三聚氰胺树脂胶粘剂中浸泡，然后干燥到一定固化程度，将其铺装在刨花板、中密度纤维板或硬质纤维板表面，经热压而成的装饰板。生产时
就与基材紧密粘合在一起的。由于它与基材(一般是防潮板)结合紧密，基本上做到了无缝，所以，环保性高。可制成防火、抗震、耐热的层压板，色泽鲜艳、坚固耐热的装饰板，作飞机、船舶和家具的贴面板及防火、抗震、耐热的房屋装饰材料。目前，中高档的家具都是用它来制作。而且，三聚氰氨面板有各种不同的仿木纹款式，性能和美观都高于其它粘贴面板，所以，不需要再贴面板了。三聚氰胺板是现在家装用材的一个主流，它彻底打散了原来木材的组织，破坏了各项异性湿胀干缩的特性，尺寸极稳定，克服了实木因单体收缩，容易变形、开裂的不足，具有较好的尺寸稳定性，而且防虫，不助燃，不变形、不翘曲、耐腐蚀、容易维护清洗等特点。
（2）涂料：用丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料、固体粉末涂料的胶联剂、可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。
（3）模塑粉：经混炼、造粒等工序可制成蜜胺塑料，无毒、抗污，潮湿时仍能保持良好的电气性能，可制成洁白、耐摔打的日用器皿、卫生洁具和仿瓷餐具，电器设备等高级绝缘材料。
（4）纸张：用乙醚醚化后可用作纸张处理剂，生产抗皱、抗缩、不腐烂的钞票和军用地图等高级纸。
（5）三聚氰胺甲醛树酯与其他原料混配，还可以生产出织物整理剂、皮革鞣润剂、上光剂和抗水剂、橡胶粘合剂、助燃剂、高效水泥减水剂、钢材淡化剂等。
（6）农业：在农业中三聚氰胺是用来加在化肥中的[3]。
2.2 三聚氰胺消费市场
中国三聚氰胺的消费市场主要集中于木材加工、装饰板、涂料、模塑料、纸张、纺织、皮革等行业，其中木材加工业占国内总消费量的56%。另外，中国三聚氰胺约有50%用于出口，主要出口到日本、韩国、新加坡、西班牙、德国、印尼、意大利等国家。
国内需求量较大的市场是广东、广西、苏南地区，年需求量在1.25万吨左右。在两广地区，山东海化魁星股份有限公司、四川川化集团公司、合肥四方集团公司三家的市场份额约占整个市场用量的65%。苏南市场用户多为个体私营企业，需求量虽大，但竞争很激烈，经营风险较大，其次是上海市场，年需求量在1.0万吨以上，主要被南京金星、石化实业有限公司、四川川化集团公司、合肥四方集团公司占有。华北市场年需求量约1.20万吨，但该地区生产厂家众多，价格混乱，竞争无序，因此一些厂家限制了对该地区的供货。东北、浙闽、西北、湘赣等地的市场需求量不断增
加，价格也比较稳定，西部地区随着大开发的进行，今后的用量也将不断的增加，重点在建筑、油漆业、涂料等方面，但由于该地区整体经济水平较差，需求不旺。
全球三聚氰胺消费总量以高于5%的幅度增长，但各地区分布不均衡。2003年，全球三聚氰胺需求量约110万吨，主要集中在欧美和日本等发达国家和地区，约占全球总消费量的60%～70%，主要用于涂料、装饰纸或层压板、纺织或造纸、模塑料以及胶粘剂等行业。预计2004年全球消费量约为120万吨，比2003年增长约8%。
近几年中国三聚氰胺消费快速增长，目前保持10%～20%的增长幅度。随着中国经济总体发展水平的不断提高，人们对高档建筑装饰材料的需求不断增加。据中国木材流通协会地板委员会的资料显示，今年中国强化木地板市场消费量同比增长约30%，而国家自2002年7月1日正式实施建筑材料控制游离甲醛含量的强制性标准，也极大地刺激了三聚氰胺在强化木地板生产方面的消费。但其他方面的需求增长相对缓慢。预计，未来几年中国对三聚氰胺消费增长幅度仍会保持在10%～20%[4]。
3 用三聚氰胺制假蛋白原因及原理
3.1 添加原因
奶粉有毒是因为其中含三聚氰胺，可能是在奶粉中直接加入的，也可能是在原料奶中加入的。
牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为它能冒充蛋白质。
食品都是要按规定检测蛋白质含量的。要是蛋白质不够多，说明牛奶兑水兑得太多，说明奶粉中有太多别的东西的粉。
但是，蛋白质太不容易检测，生化学家们就想出个偷懒的办法：因为蛋白质是含氮的，所以只要测出食品中的含氮量，就可以推算出其中的蛋白质含量。
因此添加过三聚氰胺的奶粉就很难检测出其蛋白质不合格了，这就是三聚氰胺的假蛋白。
3.2 假蛋白原理
由于中国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被作假的人称为“蛋白精”。
蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16％左右，而三聚氰胺的含氮量为66％左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使
劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现[5]。
奶粉事件：各个品牌奶粉中蛋白质含量为15-20%（晚上在超市看到包装上还有标示为10-20%的），蛋白质中含氮量平均为16%。某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量为66.6%，是鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。
微溶系指1g(ml)溶质能在100ml～1000ml溶剂中溶解，三聚氰胺在水中微溶，在牛奶这种水包油型的乳液中溶解度未找到实验数据，应该比水的溶解度要好一些，待验证。
检测方案：在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。因此，德国莱茵TüV集团参照美国食品化学品法典(FCC)HPLC-UV定量方法，同时还可采用HPLC/MS检测方法（实验室方法）对婴儿食品，宠物食品，饲料及其原料(包括淀粉，大米蛋白, 玉米蛋白, 谷朊粉、粮油等)开展的检测业务，检测结果具备权威性。
三鹿奶粉假蛋白的另一种解释为，企业加入的是尿素，而原奶直接变成奶粉是在高温下进行的，高温使得尿素发生脱水反应，生成三聚氰胺，因此最终产出的奶粉中还有三聚氰胺。
3.3 其他可能被添加的商品
1.鸡蛋（可能是饲料厂家为使饲料蛋白质含量检测起来更多，卖得更多而添进饲料里，鸡吃了这种饲料，下的蛋也就含有三聚氰胺）
2. 饲料 (以家禽饲料为主)
4 食物中三聚氰胺的检测方法
4.1 家庭简易检测法
面对当前社会不安全的食品品质形势，对食品进行安全检测变得相当必要。然而专业检测方法与设备并非普通人可以完全掌握，于此举出一种家庭用简易检测方法，仅供参考。
方法步骤：
1．按比平常浓的分量用热水冲奶粉，充分搅拌到不见固块，然后放入冰箱，待牛奶静置降温。
2．准备黑布一块和空杯一个。把黑布蒙在空杯口上作为过滤器。
3．将冷却的牛奶倒在黑布上过滤。
4．如果有白色固体滤出，则用清水冲洗几次，排除其它可溶物。
5．如果冲洗后发现有白色晶体，可以将晶体放入清水中，该晶体如果沉入水底。那就很可能是三聚氰胺，这种奶粉不能用了。
这种方法可能无法发现微量的三聚氰胺，但微量的三聚氰胺使孩子得结石的可能性也低得多，至少可以把把关[6]。
4.2 化学检测法
常用的化学检测方法有：GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺；Spectra-Quad 实现三聚氰胺含量在线检测；超高效液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺；反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量；高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺；高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量；高效液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量；固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺；液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺；液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留。
4.2.1 仪器与条件
Agilent1100高效液相色谱仪(美国，Agilent公司);二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm，柱温：40℃。
(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm);缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min。
(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm);流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min。
离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰尔科技有限公司)。
4.2.2 试剂与样品
宠物饲料样品(农业部饲料供应中心提供)；甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供；氨水、乙酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司；三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sigma公司)；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。
4.2.3 实验方法
①样品前处理方法
(1)标准样品配制：
取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。
(2)提取：
称取饲料样品5g，加入50mL 0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。
然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL 过混合型阳离子交换小柱(PCX)。
(3)净化(PCX小柱，60mg/3mL)：
a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b)上样：加入提取液3mL
c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;弃去淋洗液并将小柱抽干。
d)洗脱：5mL 5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
e)浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS 分析。
②HPLC检测方法
三聚氰胺HPLC-UV检测方法:
三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留粉差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分裂，依照美国食物药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela) ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分裂效果，剖析色谱图如图①所示。
图①：Venusil ASB 色谱柱分裂三聚氰胺的谱图
(a) 色谱柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm；尺度：FDA方法；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；波长：240nm
(b) 色谱柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm；尺度：中国农业部颁尺度方法；缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠；流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱温：40℃；波长：240nm
由上图可以看出：用PCX柱净化样品，可以得到满足的回收率，此方法处理样品，比FDA公布的前处理方法更加准确、可靠。
③三聚氰胺LC-MS检测方法
由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了方法的应用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留粉差，不能得到较好的分裂定量。
基于此问题，艾杰尔科技公司自主开垦了新的方法，采用艾杰尔(Agela) ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分裂。因此方法中流动相不含
离子对试剂，可以用于质谱质谱检测。
与FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation (HPLC-UV)》相比较，该方法大大降低了最低检测限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm），提高了检测灵敏度。
以该方法分别在ASB-C8 4.6×250mm ASB-C18 4.6×250mm，得到的谱图如图②所示。
图②：LC-MS方法检测三聚氰胺的谱图
缓冲液：10mM的NH
Ac；流动相：Buffer:：ACN=95：5；流速：1.0mL/min；进
4
样量：样品先用70%AcN溶解成约1mg/mL，用ACN稀释成0.1mg/mL，进10μL；柱温：40℃；波长：240nm
④结果与讨论
(1)阳离子交换柱(PCX)
三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合
H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO
3
苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：
a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
b)批次重复性好。
c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。
(2)LC-MS方法优点：
a)检测过程简便：无须添加离子对试剂，三聚氰胺就可得到良好的保留与分离，避免了配制离子对流动相的复杂过程。
b)提高了检测的灵敏度：无离子对试剂，可以用于质谱检测器，大大降低了最低
检测限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)。
c)降低了检测成本：不用离子对试剂，就不再需要买价格较贵的离子对试剂了，从而降低了检测成本。
d)延长了色谱柱的使用寿命：避免了使用离子对试剂减少色谱柱寿命的影响。
e)该方法所使用的色谱柱具有通用性：无论是用FDA方法、中国农业部部颁标准方法和本公司开发的LC-MS方法，使用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱均能得到一个很好的检测结果，从而给客户提供了多种选择空间[7]。
国家食品质量监督检测中心有关人士说，在现有的国家标准奶粉检测中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。也就是说，三聚氰胺不属于常规检测项目，正常情况下，很少有人会想到去检测它。
4.3 酶标仪检测法
4.2中的那些色谱方法非常精确，但对于设备和操纵而言，预备及运行的本钱都非常高。因此迫切需要一个简单的高通量筛选方法，以公道的本钱精确检测牛奶中三聚氰胺的残留量。
经典的ELISA（酶联免疫吸附测定）测量可以作为一个理想的解决方案。这种方法可以在微孔板中进行，因此样品数目较多时可以同时进行，仪器本钱也不高。目前已经开发了免疫测定试剂盒，可以高效、简便、灵敏地检测乳制品、动物饲料以及宠物食品的原料中的三聚氰胺污染物。
以下是关于如何使用简便的ELISA，高灵敏地筛选牛奶样品中的三聚氰胺。这些检测需要具备足够的灵敏度，检出10μg以下的三聚氰胺，这是全世界的监管机构对非婴儿类食品设定的界限。
4.3.1 检测原理
本研究中，使用了两种来自不同生产商、但是基本原理相同的三聚氰胺ELISA 商品试剂盒。未知样品以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的三聚氰胺均置于三聚氰胺抗体包被的微孔板孔中。HRP标记的三聚氰胺与未知样品中的三聚氰胺竞争结合抗体。结合率相当于HRP标记物与游离三聚氰胺的浓度比。因此，与抗体结合的HRP 标记物的量与样品中游离三聚氰胺的数目反向相关。
结合阶段之后，使用微孔板清洗机往除未结合的物质，加进HRP显色底物。测定的HRP酶活与HRP标记的三聚氰胺的数目成正比，并且与未知样品中三聚氰胺的浓度
有关。规定的孵育时间之后中止反应，测定形成的有色染料的量。假如样品中不存在三聚氰胺，通过形成的有色染料的数目及较高吸收值可以得知酶活水平较高。未标记的游离三聚氰胺的量增加，则活力水平和吸收值降低。因此根据校准曲线就可以直接测定三聚氰胺的浓度。
4.3.2 样品制备
三个不同的牛奶样品——自然的全脂牛奶、脱脂牛奶以及自然奶粉制成的人造奶——加进纯的三聚氰胺。这三种不同的乳制品与三聚氰胺储备液（浓度为2mg/mL的蒸馏水溶液）混合制成加标样品。三种牛奶均加进20及100μg/L的三聚氰胺，全脂和脱脂牛奶样品另外再加进浓度为550及1000μg/L的三聚氰胺。
对于第一种检测试剂盒，加标牛奶样品按试剂盒操纵方法进行制备：
①在洁净试管中加进大约1mL加标牛奶样品；
②样品在1500g、10℃下离心10分钟；
③取脂肪层下部分200μL转进洁净试管中；并且牛奶乳清中加进800μL检测稀释液，仔细混合稀释样品。
对于第二种试剂盒，根据生产商直接提供的信息，对样品的制备方法稍加调整，以进步检测灵敏度。假如根据原有的说明制备牛奶样品，会发现三聚氰胺检测灵敏度低于第一种方法，由于根据原有的说明检测样品被稀释过量：
①洁净试管中加进大约1mL加标牛奶；
②样品在1,500g、10 ℃下离心10分钟，分成3层；
③取中层250μL，转进洁净试管中；并且
④取出液体以1:3的比例加进10%的甲醇/PBS溶液（20mM）。
两种ELISA试剂盒的使用都参照生产商的说明。抗体包被的微孔中加进三聚氰胺标准品或加标样的加进量为100或150μL（取决于试剂盒）。随后每一个微孔中加进50μL HRP——三聚氰胺标记物，混匀微孔板并在室温孵育30分钟。蒸馏水冲洗往除未结合的样品。300μL蒸馏水重复冲洗4次。100μL HRP——底物分装进每一个微孔中，微孔板在室温下再次孵育20或30分钟（取决于试剂盒）。加进100μL终止液终止反应，使用六种不同的酶标仪在450nm测定吸收值。制作校准曲线，用于确定未知浓度。（该曲线可以根据吸收值或是正确值进行计算，空缺对照的吸收值被设定为100%。）
4.3.3 校准曲线及检验灵敏度
利用第一种试剂盒制作的三聚氰胺校准曲线，使用了六种不同型号的酶标仪进行测定。计算第二种试剂盒的校准曲线时，只使用了两种酶标仪。以前的数据显示检测仪对结果没有影响。该方法的检测限（LOD），是使用标准IUPAC 3*SD方法，根据校准数据以及空缺对照样品的数据进行计算。
这些方法所需的丈量范围，与所有酶标仪具有良好正确度的波长范围一致。这些方法的检测限在很大程度上取决于测光读数仪的正确度和精确度。因此，LOD值之间仅存在极小的不具备明显性的差异。对于两种试剂盒，低于10μg/L的三聚氰胺浓度能够轻易检出。因此，ELISA方法检测三聚氰胺的正确度与LC/MS/MS相当。
4.3.4 三聚氰胺的测定
三种不同的牛奶加进纯的三聚氰胺，用两种试剂盒进行分析。采用一系列不同的光度计进行丈量。
数据表明，两种试剂盒测定的酶活非常接近，回收率差异小于10%。此外，两种试剂盒都存在一个相同的趋势，即三聚氰胺高浓度样品的浓度丈量值稍偏低；不过，这对这些方法的使用不会产生影响，由于所有样品还会作为筛选检测的高浓度阳性样品进行测定。因此，结果明确表明，ELISA检测适适用于筛选，包括未知牛奶样品中三聚氰胺的检测。
根据前述结果，两种测试都能用于正确测定乳制品中三聚氰胺的残留量。测试的灵敏度与质谱分析的灵敏度相当。不过，与色谱方法相比，ELISAs具有本钱方面的上风。这种简便、高通量的筛选方法能够以较低的仪器本钱、适中的运行价格，对上千个样品进行大规模的筛选。
固然这些方法对牛奶样品中高浓度三聚氰胺的测定值稍低，但是其灵敏度达到的水平依然适合对三聚氰胺进行筛选，作出有/无的判定。当这些方法用于筛选时，阳性样品随后仍然需要使用LC/MS/MS 或 GC/MS/MS方法确定三聚氰胺的确切含量。
这种快速（总的检测时间：大约1小时）并且具备本钱效益的方法可以检测牛奶中三聚氰胺的残留量，从而对乳制品进行高效的筛选，这确保了任何污染物都能被快速、简便地发现[8]。
5．造假产品的危害及纯蛋白检测方法
5.1 三聚氰胺毒性危害
目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3克/公斤体重。据
1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片也只说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。然而，2007 年美国宠物食品污染事件的初步调查结果认为：掺杂了≤6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的结论画上了问号。但为安全计，一般采用三聚氰胺制造的食具都会标明“不可放进微波炉使用”。
国家卫生部于2008年9月12日发布了“与食用受污染三鹿牌婴幼儿配方奶粉相关的婴幼儿泌尿系统结石诊疗方案”，有关方面可以参照。
方案中指出结石绝大部分累及双侧集合系统及双侧输尿管，这与成人泌尿系统结石临床表现有所不同，多发性结石影响肾功能的概率更高。由于患儿多不具备症状主诉能力，家长需要加强对相关儿童的观察，依靠腹部B超和（或）CT检查，可以帮助早期确定诊断。在治疗方面，目前没有针对三聚氰胺毒性作用的特效解毒剂，临床上主要依靠对症支持治疗，必要时可以考虑外科手术干预，解除患儿肾功能长期损害的风险。早期诊断、早期治疗，是使患儿早日康复的关键。
三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。
美国食品药品管理局(FDA)食品安全高官史蒂芬·桑德洛夫表示，研究发现，在食品中只有同时含有三聚氰胺和三聚氰酸这两种化学成分时才对婴儿健康构成威胁。
这看来虽然三聚氰胺和三聚氰酸共同作用下才会导致肾结石，但是三聚氰胺在胃的强酸性环境中会有部分水解成为三聚氰酸，因此只要含有了三聚氰胺就相当于含有了三聚氰酸，其危害的本身仍源于三聚氰胺[9]。
5.2 人体对其耐受标准
三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，在动物体内新陈代谢很快而且不会存留，主要影响泌尿系统。
三聚氰胺量剂和临床疾病之间存在明显的量效关系。三聚氰胺在婴儿体内最大耐受量为每公斤奶粉15毫克。专家对受污染婴幼儿配方奶粉进行的风险评估显示，以体重7公斤的婴儿为例，假设每日摄入奶粉150克，其安全预值即最大耐受量为15毫克/公斤奶粉。
根据美国食物及药物管理局的标准，三聚氰胺每日可容忍摄入量为每日0.63毫克/公斤体重[10]。
5.3 相关致病案例
2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明：掺杂了≤6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。
2007年深圳检验检疫局从台湾进口的3批“爱族牌”观赏鱼饲料检出三聚氰胺，且三聚氰胺含量较高，分别为0.35 g/kg 、0.47g/kg 、0.51g/kg。这3批鱼饲料共846千克。
据美国食品药品管理局(FDA)官方消息，美国FDA首次在美国国内生产的饲料中发现含有三聚氰胺，有关企业已经开始自动召回相关产品。含有三聚氰胺的饲料添加剂来自俄亥俄州托莱多市Tembec BTLSR公司和科罗拉多州约翰斯敦市Uniscope公司。
2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。
国家质检总局近日紧急在全国开展了婴幼儿奶粉三聚氰胺含量专项检查。此次专项检查对其余109家企业进行了排查，共检验了这些企业的491批次产品。阶段性检查结果显示，有22家婴幼儿奶粉生产企业的69批次产品检出了含量不同的三聚氰胺。
山西省阳泉市郊区检察院日前批准逮捕7名生产销售有毒有害食品——三聚氰胺含量严重超标奶粉案犯罪嫌疑人。经检察机关查证:2009年12月，阳泉市金福来乳业有限公司利用鲜奶和顶账回来的过期奶粉加工成26吨奶粉，在未检测的情况下将该奶粉销往湖南、河北等地，该奶粉三聚氰胺含量严重超标，该案涉案区域广，社会影响极大。阳泉市郊区公安分局提请批准逮捕该公司法定代表人兼总经理王志刚等7名涉案犯罪嫌疑人后，阳泉市郊区检察院集中办案力量，在4日之内，审阅700多页卷宗，形成30多页的案件审查报告。目前此案还在进一步审理中。
5.4 WHO限量标准
世界卫生组织（WHO）官员表示，除了婴儿配方奶粉之外，大多数食品中含有微量的三聚氰胺不会对身体造成伤害，但该组织与美国和欧盟共同制定了监管者应实施的严格限量标准。
世界卫生组织于2008年12月5日在加拿大首都渥太华召开了一次食品安全专家会议。与会人员决定，虽然食品中根本不应存在三聚氰胺，但每公斤体重每天最多可
以容忍0.2毫克三聚氰胺的摄入。
世界卫生组织负责食品安全问题的官员约尔根·施伦德表示，这一标准比欧盟0.5毫克的限量更低。美国食品和药物管理局最初将限量定为0.63毫克，后来将每天可容忍的摄入量降低为0.063毫克。最近，世界各国的奶制品都被检测出受三聚氰胺污染。各国政府将参照世界卫生组织的标准制定本国的最低食品安全标准。
5.5 纯蛋白检测方法
面对层出不穷的造假，正规严格的营养测定应该是奶粉等待检样品中的真实蛋白质含量，这在发达国家就是测定所谓的纯蛋白(或称真蛋白)，且被先于中国采用为食品工业的日常标准检测方法。
食品或饲料中测定纯蛋白，也是检测牛奶氮含量的国际标准（ISO 8968）。其实，它就是把凯氏定氮法做了些改进，包括中国的实验室在内都已经应用很多年了。
本法所指的纯蛋白，同样是测出食品中的含氮量×6.25来计算。它是通过分离掉样品处理液中的非蛋白质氮，测定剩下的真蛋白氮来实现的。实际上就是只要多一道步骤即可：
先用三氯乙酸处理样品处理液。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量，需要的话还可以测定滤液中冒充蛋白质的氮含量。
如果中国早改以此为标准，食品和饲料中用非蛋白质的三聚氰胺之类冒充的假蛋白就无所遁形了。
6. 结语
三聚氰胺虽是一种用途广泛的有机化工原料，但添加在食品中，不仅对食品业具有不利影响，还对人类健康存在严重威胁，是部分不法商人良心的缺失，也是社会相关部门人员的失职。本文通过概述三聚氰胺的对人类的危害，以及部分先进检测方法，表明当前社会食品安全任务迫在眉睫，亟待整顿。我们应该大力推进食品科技进步，制定和完善食品行业政策法规，打打击掺杂使假、违规添加违禁行为，全国上下齐心协力，共同确保食品安全，使中国食品工业在新世纪里健康发展！
参考文献
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奶粉中三聚氰胺含量测定——实验步骤
高效液相色谱(HPLC-UV)法测定奶粉中三聚氰胺的含量一、实验目的： 测量奶粉中三聚氰胺的含量是否达标。 二、仪器： 高效液相色谱仪，离心机，固相萃取装置，柱温箱，紫外检测器，C18柱，超声波清洗器，pH 计，电子天平，氮气吹干仪，涡旋混合器；5mL移液管1支,1mL刻度移液管1支，25mL容量瓶1个，100mL容量瓶6个，100mL烧杯1个，微量进样器一支。 三、试剂： 三聚氰胺标准品，1%三氯乙酸，氨水，柠檬酸，庚烷磺酸钠（色谱纯），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），二次水，甲醇水溶液（准确量取50mL甲醇和50mL水，混合备用），5%氨化甲醇（量取5mL氨水和95mL甲醇混合备用），离子对缓冲溶液（准确称取柠檬酸和庚烷磺酸钠加水溶解后调节pH=3，定容至1L备用），三聚氰胺储备液（准确称取100mg三聚氰胺，在100mL容量瓶中用甲醇水溶液定容），净化柱（固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯），氮气。 四、实验步骤： 1.样品预处理： 准确称取2g样品，用10mL 1%三氯乙酸溶解后转移至25ml容量瓶中，乙腈定容。超声提取10分钟后离心，干过滤。用5mL移液管准确移取5mL过滤后的溶液过净化柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤并抽干后后用约6mL 5%氨化甲醇洗脱。洗脱液用氮气吹干后用1mL流动相定容，涡旋混合1分钟后经μm有机相滤膜过滤后进样。 2.色谱条件： C18 色谱柱（150 mm× mm，5 μm），以离子对缓冲溶液+乙腈（85+15）作为流动相，流量为 ml/min，柱温为35 ℃，检测波长为240 nm，进样量为20 μl。 3. 标准曲线的绘制： 将三聚氰胺标准储备液（×10^3 mg/L）用甲醇-水溶液（1+1）逐级稀释得到浓度为、、、、、
高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
液体乳中三聚氰胺的快速检测 胶体金免疫层析法(KJ201907)
附件7 液体乳中三聚氰胺的快速检测 胶体金免疫层析法 (KJ201907) 1范围 本方法规定了液体乳中三聚氰胺的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳和发酵乳中三聚氰胺的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的三聚氰胺与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中三聚氰胺进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 3.1.1 甲醇。 3.1.2 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 3.1.3 1mol/L盐酸：移取83 mL浓盐酸，加入900mL水中，定容至1 L。 3.1.4 甲醇水溶液：准确量取50 mL甲醇和50 mL水，混匀后备用。 3.1.5 稀释液：准确称取6.05 g Tris（3.1.2）和8.5 g 1mol/L盐酸（3.1.3），加水定容至1 L，混匀后备用。 3.2参考物质 参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥99%。 表1 三聚氰胺参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液的配制 三聚氰胺标准储备液（1000 μg/mL）：精密称取适量三聚氰胺标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1000 μg/mL的三聚氰胺标准储备液；或可直接购三聚氰胺标准储备液。4℃避光保存备用，有效期3个月。 —1—
三聚氰胺生产的工艺流程及其理化性质
三聚氰胺工艺流程及其理化性质 三聚氰胺英文名MelaMine，别名蜜胺、三聚酰胺，是一种用途广泛的树脂原料。分子式 C N H ，分子量126.13，外观为白色结晶粉末，熔点354℃，升华热19千卡/公斤，燃烧热-469.98千卡/克分子℃，比重1.573，堆积密度≥700Kg/m 。 溶解特性：能溶于甘油、呲啶、热乙二醇、乙醇胺、乙酸、甲醛等；几乎不 溶于乙醚、苯、四氯化碳；微溶于水。 三聚氰胺主要用来与甲醛缩合，生成三聚氰胺树脂，该树脂属于热固性树脂，具有耐热，耐老化，耐酸碱，阻燃、电器性能好，以及强度高，外观光泽好等优点，使用相当广泛，其主要用途在于涂料、装饰板、层压板、模塑料、粘合剂、纤维及纸张处理剂、农药中间体和建筑用防水剂及防渗剂等。 现以三聚氰胺为原料加工的几种主要产品叙述如下： 1、装饰板、层压板 装饰板是装饰板材的统称，可制作装饰板的树脂很多，如：三聚氰胺树脂、酚醛树脂、环氧树脂、丙烯酸树脂、聚丙烯树脂、聚氯乙烯树脂等。 由于三聚氰胺甲醛树脂制作的装饰板不但外观美观，而且具有良好的耐水性、耐热性及耐化学药品性，广泛用于航空、火车、轮船、建筑物墙壁、家具、厨房等。三聚氰胺装饰板在装饰板生产中占有很大比重。 2、蜜胺塑料 三聚氰胺甲醛塑料，三聚氰胺尿醛塑料统称蜜胺塑料，它与尿醛塑料都属氨基塑料，它们的制备方法和设备都相同，一般都把这两种产品联系起来讨论。 与尿醛塑料相比，蜜胺塑料具有色泽鲜艳，多样，不易褪色，外观手感好，表面强度高，不易发毛，易洗涤，耐溶剂，无毒、无臭味等优点。 3、涂料 三聚氰胺甲醛树脂可以作醇酸系、丙烯酸系、环氧涂料的交联剂，主要用于氨基树脂漆中，氨基树脂漆光泽好，室外耐久性强，抗化学药品性强，变色小，主要用于建筑、桥梁、运输、车辆、机器设备、家具及家电产品的面漆，其特点 是色泽光亮，耐腐蚀，耐老化。 4、粘合剂 尿醛胶、三聚氰胺改性尿醛胶是木材工艺的重要粘合剂。尿醛胶是木材工艺用量最大的胶种，在日本三聚氰胺的最大用量是制造三聚氰胺尿醛胶。 用三聚氰胺改性的尿醛胶具有胶合力强，耐水、耐热性能均优于普通尿醛胶。 5、混凝土减水剂 减水剂是一种混凝土的外加剂，在制作混凝土时加，加入减水剂可以减少水和水泥的用量，提混凝土的强度。目前我国有减水剂50多个品种，主要有木质素磺酸盐、磺酸钠甲醛缩合物、磺化三聚氰胺甲醛树脂、古玛隆树脂、石油树脂 磺酸盐等。 使用高强度减水剂（如SM减水剂），并不是单纯为了节约水泥，而是为了发挥所长，取得普通减水剂达不到的效果。 6、纺织方面 三聚氰胺树脂作为纺织纤维的处理剂，可使纤维具有防水、防老及防皱的性能，使织物挺刮，手感好，具有明亮光泽。 7、造纸方面
三聚氰胺的检测方法
三聚氰胺的检测方法 工业上测定三聚氰胺的纯度通常采用苦味酸法和升华法。苦味酸法方法原理: 将水加入试样, 加热溶解后, 加人苦味酸溶液, 称量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的质量, 即测得三聚氰胺纯度含量。分析步骤: 称取试样, 置于500 ml 锥形瓶中, 同时加入水, 加热溶解; 冷却后, 加入酚酞指示液3 滴, 若显色, 加入硫酸溶液, 直至溶液颜色消失, 若有不溶物, 需过滤, 水洗; 把滤液和洗液合并, 移人500 ml 容量瓶中, 加水至刻度, 仔细振摇混合后, 准确 吸取100 ml 置于500 ml 烧杯里; 将此溶液加热至80℃, 另加入已加热至80℃的100 ml 苦味酸溶液, 冷却至室温后, 保持在15℃以下约8 小时; 用已恒重的玻砂过滤器过滤, 之后,先用约100 ml 苦味酸三聚氰胺的饱和溶液洗涤, 再用水洗; 烘干玻砂过滤器, 置于干燥器中冷 却后, 称量求得沉淀物质量。升华法测定原理: 在升华装置中将试样在负压下进行加热, 让三聚氰胺完全升华后, 称其残渣量, 即测得三聚氰胺纯度。分析步骤: 称取试样, 置于预先干燥了的且已知质量的试样容器里; 将试样容器置入减压升华装置内,待完全密闭后, 开启真 空装置缓缓吸引, 并调节装置内的温度, 经2 小时升华结束; 取出试样容器, 冷至室温后, 称量试样容器的质量。上述两种测定方法准确度均较高, 但操作繁琐, 分析时间太长,有人推荐采用电位滴定法。具体测定方法, 首先测定三聚氰胺溶液中总固体的含量, 称取样品于200 ml烧杯中, 加入100 ml 蒸馏水, 放于石棉网的电炉上加热,在沸腾的情况下搅拌溶液, 使试样完全溶解。在电磁搅拌状态下, 用硫酸标准溶液滴定热溶液至pH 值为5 左右。流水冷却溶液至室温, 滴定, 每次准确加入0.1 ml 硫酸标液,并记下相应的pH 值, 直至pH 值约为3。计算出等当量点时消耗硫酸标液的体积。结果计算按公式Me=S×6.307×V×F /m ( 其中式中:Me 为溶液中三聚氰胺的含量, %; S 为溶液中总固体的含量, %; V 为等当量点时消耗硫酸标液的体积, ml; F 为0.5 mol /L 硫酸标液的校正系数; m 为滴定时所标取总固体的质量; 6.307 为换算系数) 。 三聚氰胺的样品前处理及最新LC-MS检测方法：ASB亲水色谱柱 开发的三聚氰胺的样品前处理及最新LC-MS检测方法：ASB亲水色谱柱 三聚氰胺的样品前处理及最新检测方法 摘要三聚氰胺是一种重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺树脂，是建筑业中常用的防火材料，本来与食品、饲料行业毫不相干，但是发生在美国的数起饲料致死宠物的事件使两者联系在一起。经过调查，发现这些进口饲料中含有一定浓度的三聚氰胺，对此，美国食品药品监督管理局（FDA）要求饲料厂商提供三聚氰胺的检测报告，因此，三聚氰胺事件也使得分析领域掀起了检测方法的开发热潮，艾杰尔科技有限公司具有较高的敏感度，迅速开发了优越的检测方法，本文将详细论述。 关键词三聚氰胺，样品前处理，LC-MS 1 前言 三聚氰胺事件变成社会热点话题是在07年3月份，美国大量召回被三聚氰胺污染的宠物饲料，起因于宠物饲料致死猫狗的事件。据不完全统计，北美地区仅美国因食用有毒饲料而死亡的宠物就有上万只, 相关投诉不计其数，美国食品药品管理局调查显示，在回收的宠物食品、死亡动物的尿液结晶和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺，研究人员还发现, 回收宠物食品所用的小麦谷蛋白添加物中有较高浓度的三聚氰胺存在。尽管国内尚无动物中毒死亡或产生不良反应的报道，对于三聚氰胺的毒性也有些争议，但三聚氰胺不是饲料原料，也不是国家允许使用的饲料添加物。某些不法厂商添加三聚氰胺主要是为了增加产品的表观蛋白质含量，三聚氰胺被广泛的添加到淀粉、谷朊粉、蛋白粉中，致使不仅是饲料生产商，其它的食品工厂也需要三聚氰胺的检测以保证他们产品的安全。 本文采用固相萃取法对样品进行前处理，并对比了不同的检测方法,包括FDA公布的检测方法〔1〕对三聚氰胺分析的影响。 三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3 。分子量：126.12，是一种重要的氮杂环有机化工原料〔2〕。三聚
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
三聚氰胺的生产工艺
三聚氰胺生产工艺 以尿素为原料生产三聚氰胺分为高压法、中压法、低压法和常压法四种工艺。 （1）低压尿素分解法（见图1） 肥料级尿素在贮罐中熔融后，用几个喷嘴喷入反应器中，以流态化的氧化铝为催化剂，将预热至400℃的循环氨气通入反应器保持流态化，反应压力为常压或稍高于大气压。反应吸热，反应器内装有加热盘管，以熔融盐作为加热介质，维持反应温度380℃左右。喷入的尿素自行蒸发，反应生成三聚氰胺、二氧化碳和氨，转化率为95%。反应气体从反应器顶部出来，先进入气体冷却器，冷却后的温度在三聚氰胺的露点以上。在此温度下，密勒胺和密白胺等高沸点副产物结晶析出，和催化剂粉末一起经过滤器除去。过滤后的气体进升华器，以冷却至140℃的循环气使升华器的温度维持在170℃～200℃，98%的三聚氰胺以微粒状结晶析出，而未转化的尿素仍留在气体中，三聚氰胺晶体和气体通过旋风分离器分离，得到的产品纯度达99.9%，分离效率为99%[4]。 从旋风分离器出来的循环气体进入尿素洗涤塔，冷却至140℃，循环气中未被回收的固体和气体三聚氰胺及未转化的尿素在尿素洗涤塔内被洗涤回收。从洗涤塔出来的气体，一部分作为升华器的介质，一部分加压预热后循环入反应器，另一部分可返回尿素装置。 （2）中压尿素分解法（见图2） 肥料级尿素以熔融状加入内热式的一段反应器中，与氧化铝催化剂进行流化接触反应，反应压力0.7MPa，反应温度390℃，反应吸热，以熔盐载体循环加热。气体氨经加压升温至与反应器相同的温度后进入反应器，作为载体和流化介质。反应气体从反应器顶部放出并进入饱和器（操作压力与反应器同），在饱和器中立即被母液骤冷，骤冷后生成饱和氨和二氧化碳以及稀的三聚氰胺结晶料浆。料浆经洗涤器后到组式分离器，获得浓缩的三聚氰胺结晶料浆，分离出的母液回饱和器。浓缩浆液送入蒸出塔，将溶解在料浆中的氨汽提吹出。吹出之氨气，以系统生成的冷凝水吸收，后与新鲜氨混合，作为吸收塔上部的吸收液。
几种三聚氰胺快速检测方法比较
几种三聚氰胺快速检测方法比较 2007年3月,美国发生多起因食用宠物食品而导致宠物中毒死亡事件。2008年9月,中国发生因食用三鹿婴幼儿奶粉导致婴幼儿产生肾结石病症的严重事件。两起事件的原因都是在食品或饲料中非法添加大剂量三聚氰胺。因此,如何快速准确的分析食品和饲料中的三聚氰胺成为食品企业、食品管理机构和广大消费者密切关注的问题。 为科学合理地筛选快速、简便、准确、经济的三聚氰胺检测方法，中国计量院提出搭建快速检测方法测试平台的建议，并承担了科技部应急支撑项目“三聚氰胺快速检测技术测试平台的建设”。 该平台启动以来，以权威检测技术为支撑，以盲样测试结果为依据，开展技术评价，在国内首创“统一现场测试、统一评价方案、统一判别依据、统一专家评审、统一现场公布测试结果”的三聚氰胺检测方法评价模式。以国际比对互认为基础，建立乳与乳制品中的三聚氰胺气相色谱同位素稀释质谱法和液相色谱同位素稀释质谱法，为评价快速检测方法奠定了重要的技术基础。 为确保三聚氰胺检测结果的有效性，全面提高检测实验室对原料乳及奶粉中三聚氰胺检测能力水平，测试平台先后组织实施了5轮全国三聚氰胺快速检测技术方法的现场统一测试评价活动，共测试评价了56种检测技术或方法，有效推出液相色谱法、拉曼光谱法、胶体金试免疫层析法（胶体金速测卡法）、酶联免疫法(ELISA试剂盒法)4种三聚氰胺快速检测方法。 本文对常用的三种三聚氰胺快速检测方法：液相色谱法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法的原理、特点做简单介绍并对其应用进行比较。 1.液相色谱法 国家标准GB/T224002008公布了原料乳中三聚氰胺快速检测的高效液相色谱法（HPLC法）,采用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂,0.2um 微孔滤膜过滤后供HPLC测定。采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱,流动相为乙腈缓冲液(10mmol/L柠檬酸,10mmol/L辛烷磺酸钠,调节pH至3.0),采用紫外/二极管阵列检测器检测,定量限为0.3mg/kg,定量灵敏度提高,且分析时间较短。HPLC法虽然应用普遍,但存在一定的局限性,样品前处理过程复杂,仪器昂贵,对检测人员的要求高，检测成本高。 1.1原理 用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，外标法定量。 1.2主要试剂和材料 1.3.仪器 1.4检验操作：按国标GB/T224002008要求操作。 2.酶联免疫吸附法(ELISA)
三聚氰胺工艺流程
化集团有限责任公司(简称川化)从1981年开始建设国内第1套引进的大型三聚氰胺装置以来，近年来又陆续建成投产了几套三聚氰胺装置。目前三聚氰胺的年生产能力已达63．8 kt，形成了以化肥为主业，三聚氰胺为次主业的产业结构，从而牢牢把握住了尿素营销的主动权，继续保持全国最大的三聚氰胺生产和出口基地的地位。 川化第4套三聚氰胺生产装置年生产能力26kt，总投资2．2亿元，采用北京清大华业科技公司改良气相淬冷常压法三聚氰胺生产工艺，全部技术和设备均实现国产化。2005年4月25日装置动工兴建，12月31日投料试车成功，生产出合格产品，创下国内同行业建设周期最短，一次开车成功的新纪录。原拟建的第5套三聚氰胺装置，已于2005年10月18日在四川泸州西部化工城合江工业园区内破土动工，该项目由川化股份有限公司、泸天化股份有限公司、四川天华股份有限公司和四川天然气化工厂共同出资建设，采用意大利欧洲技术工程承包公司的高压法生产工艺，年生产能力为30 kt，总投资4．97亿元，预计在2006年年底建成投产。 目前国内三聚氰胺生产工艺主要有荷兰DSM低压法、北京清大华业常压法和意大利欧技公司高压法3种，川化前3套三聚氰胺生产装置分别采用了这3种工艺技术。正是在总结前3套三聚氰胺装置设计、制造、建设、开车及运行等方面的经验教训的基础上，川化第4套三聚氰胺装置得以顺利开车投产。 2 荷兰DSM低压法生产工艺装置 川化第1套三聚氰胺装置采用荷兰DSM公司低压催化法生产工艺，年生产能力12 kt，在当时是国内规模最大、工艺最先进的生产装置，也是目前国内唯一的1套DSM工艺三聚氰胺装置。 该工艺自身带有1套尿素装置，以处理三聚氰胺反应产生的副产物，避免对外部尿素装置的依赖，有利于连续稳定生产和降低原材料消耗。装置于1981年12月2日建设，1983年5月 31日建成，1984年1月18日试生产。由于在工艺和设计上都存在着严重缺陷(特别是汽提塔)，先后投料试车17次，均未能取得成功。在与外商交涉无果的情况下，川化自行组织工程技术人员攻关，经过反复试验和理论核算，并借鉴合成氨老系统铜洗塔改造的经验，决定采用非均匀开孔三相塔板代替原塔内件的技术方案；经过短期调试，于1984年12月9日首次生产出了合格产品。 在开车试运转期间，又对装置作了一些改造，如对高压空压机的自动控制系统、结晶旋流器的内壁和引流管、一段甲铵冷凝器气体分布板等进行了改造，其中最重要的是对汽提塔的2次改造。 第1次是采用非均匀开孔率穿流板新技术，塔板由固定连接改为定距杆连接，终于打通流程，成功开车。第2次是将塔径扩大，降低氨损耗，使生产能力提高了50％。 自装置投产后，由于自身存在的一些缺陷，长期以来一直达不到设计能力，1985年的年产量只有设计能力的20％。通过对装置在运行中暴露出来的问题进行技术攻关和改造，解决了原工程设计和设备结构存在的100多个大小隐患，使装置的运行状态有了很大的改善。特别是20世纪90年代以来，产量直线上升，创造了连续日产40t的纪录，1996--1998年连续
三聚氰胺的检测方法
重量法、电位滴定法、高效液相色谱法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱联用法、毛细管电泳法、近红外线吸收法、比色法、免 疫学法 1.1重量法：苦味酸法和升华法。 苦味酸法的原理是将三聚氰胺样品用水溶解，再向该溶液中加入苦味酸使其与三聚氰胺生成沉淀，根据生成沉淀的量计算出样品中三聚氰胺的含量。升华法的原理是将样品置于升华装置中，使样品中三聚氰胺受热升华，准确称取剩余固体的质量。这两种方法用于工业上检测三聚氰胺的含量准确度相对较高，但分析时间都比较 长，操作繁琐，不适合高效快速检测。 1.2电位滴定法 电位滴定法在工业中检测三聚氰胺较重量法简单，实验时间较短，但准确度不高。其实验原理：以硫酸标准溶液滴定含有三聚氰胺的溶液，通过公式用等当量点时消耗硫酸标准溶液的体积计算出三聚氰胺的含量。不用于食品。 1. 3 高效液相色谱法（HPLC） 用HPLC 检测三聚氰胺含量，检出限低，准确度相对较高，可用于食品中三聚氰胺的检测。实验的一般操作步骤是：用沉淀法先将奶粉中的蛋白质沉淀，然后提取奶粉中的三聚氰胺，将提取液用阳离子交换固相萃取柱净化，最后用高效液相色谱进行检测，外标法定量。 1. 4气相色谱法和质谱联用法（GC-MS） 与HPLC 法比较，GC-MS 具有准确度高、检出限低（0.05 mg/kg），更适合食品中三聚氰胺的微量检测。该方法样品经蛋白沉淀离心后过MCX 固相萃取柱净化、氮气吹干、硅烷化衍生, 再由气相色谱－质谱联用仪检测。由于三聚氰胺为强极性化合物，难汽化，直接对其进行GC-MS 测定不但灵敏度低且峰拖尾严重，为此王征采用N，O- 双三甲基硅基三氟乙酰胺衍生化，极性的减弱使其容易进行汽化，有利于待测物和基质的分离,降低了背景化学噪音的影响。王立媛等用GC-MS 方法检测奶粉和鲜奶中三聚氰胺的加标回收率在82.3%～110.0%之间，相对标准偏差（RSD）＜10%，方法净化效果好、准确度高、灵敏度好。但是GC- MS 法需要进行衍生化, 样品处理步骤复杂,不适用于多杂质生物检材中三聚氰胺的快速筛查和定量分析。 1. 8 比色法 由于牛奶中各种蛋白质基质可能干扰三聚氰胺的检测, Fang Wei 等把基于酪蛋白的牛奶成分分离，然后向溶液中加入金的纳米颗粒。金的纳米颗粒与三聚氰胺的相互作用导致了显著的颜色变化，显示出三聚氰胺的存在。当三聚氰胺存在的时候，溶液的颜色在几秒钟内从红色变成了蓝色，而且可以通过视觉观察和分光光度测定法检测。该法提供了一种使用纳米颗粒的高灵敏度探测手段，从而防止人们因为摄入三聚氰胺而受到伤害的独特机遇，对乳制品早期筛查提供了一种可行的方法。 1. 9 免疫学法———试剂盒检测法（ELISA） 免疫学法是一种快速检测三聚氰胺的方法，其原理是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。样品经过甲醇离心处理，氮气吹干再次甲醇溶解后放入到试剂盒中，加入三聚氰胺HRP 酶标记物，轻轻混合60 s，孵育0.5 h。将微空中的溶液倒入水槽中，用洗液洗板多次。在吸水纸上拍打，向个孔中加入底物溶液，孵育0.5 h，最后加入终止液体，用酶标记仪在450 nm 下测吸光度。然后以三聚氰胺浓度半对数为横坐标做标准曲线, 确定被测样品的浓度。该法操作简便，分析速度快，可大批量筛选，其检出限达到10 ug/k。但是在检测过程有假阳性问题，因此对阳性样品需确证方法进行确证。
三聚氰胺 工艺过程概述
第四章工艺过程概述 一、尿素和工艺气体的处理 参见“管道及仪表流程图-熔融尿素加料系统；尿素洗涤工段，工艺气压缩工段。” 本系统的工艺目的： （1）获取满足工艺需要素 （2）回收未反应物 （3）获取结晶冷气及反应器载气 本系统由熔融尿素加料系统、尿素洗涤塔(1E0201)、液尿泵(1J0201A/B)、空气冷却器（1C0201A/B 1C0202C/D）、载气压缩机(1J0301)、等设备及其相关的管线和仪控部分组成。 熔融尿素加料系统由两个回路组成，一个回路是熔融尿素来自尿素车间经快速三通切断阀 HV10101，由 FICQ10101/ FIQ10102 控制和计量后进入尿素洗涤塔(1E0201)；或另一回路由尿素斗式提升机(1L0101)、尿素熔融槽(1C0101)、尿液循环泵(J10102)等设备组成，颗粒尿素经斗式提升机(1L0101)送至尿素熔融槽熔融后(1C0101），由尿液循环泵(J10102)升压，再经流量调节器FIC10104控制和计量后送入尿素洗涤塔（1E0201）。尿素洗涤塔（1E0201）顶部和下部外壁上设有蒸汽加热管，供装臵开停车时使用；顶部有刮刀，用以清除操作过程中附在壁上的物质；上部和中下部设有四台内冷器；下内冷器以下，有气液出口，与4 个气液分离器相连，气液在此分离后，气体从液分离器中心管流出去经冷气总管送往后工序，液尿进入(1E0201)塔釜。(1E0201)塔釜设有液尿液位计（LIA-10201A/B）。 尿素洗涤塔(1E0201)底部,135-140℃的熔融尿素由液尿循环泵
(1J0201A/B)送出后，一部分被送往三胺反应器，另一部分则经两组尿洗塔喷头进入(1E0201)塔顶部及中上部。来自捕集器出口的工艺气体(-210℃)送入尿素洗涤塔(1E0201)上部，与从上部经6个尿素喷嘴喷入的液尿，及中上部经12个尿素喷嘴喷入的液尿并流而下，气液充分密切混合，完成传热传质，经尿素洗涤塔洗涤后，工艺气体中的未反应的尿素和未被捕集器(1L0702A/B)捕集下来的三聚氰胺细粉被熔融尿素洗涤下来，并混入尿素之中得以回收利用，工艺气体温度降至135-140℃，而液尿的温度则则达到135-140℃。 工艺气体和液尿流经尿素洗涤塔(1E0201)的内冷器时，将一部分热量传给内冷器管间的水，使水汽化，产生的蒸汽进入空气冷却器(1C0201A/B 1C0202C/D)被冷凝成水，水靠位差返回(1E0201)的内冷器壳程。尿素洗涤塔(1E0201)内液尿的温度(TIA-10202)可通过调节空气冷却器(1C0201A/B 1C0202C/D)的水蒸汽压力调节系统(PIC-10203a/b/c/d)控制在135-140℃范围内。而空气冷却器(1C0201A/B 1C0202C/D)的水蒸汽压力(PIC-10203 a/b/c/d)则通过调节其风扇转速来加以控制。空气冷却器(1C0201A/B)产生的蒸汽也可通过(PIC0202)控制压力，送入低压蒸汽管网，空气冷却器的液位通过补充蒸汽冷凝液维持。 正常工况下，两台液尿泵(1J0201A/B)运行一台，备用一台。循环至尿素洗涤塔(1E0201)内的液尿流量由流量计(FIA-10201)显示并报警，正常流量～840m3/h，流量大小通过调整液尿泵(1J0201A/B)出口阀开度进行调节。进入顶部的尿液流量通过(TV10207b)控制。 汇入总管PG203 内的工艺气体，大约含70％的NH 3和30％（V）的CO 2 ， 经过载气除沫器(1F0701)除沫后气体被分配成三部分，即结晶器冷气、反应器载气和尾气。尾气流量由(PICA-10703)前馈-反馈压力调节回路自动控制在 0.32Mp 来控制。结晶冷气流量根据结晶器出气
三聚氰胺检测方法
MARS-HPLC测定不同基质中的三聚氰胺 摘要：MARS(Multi-adsorption Reverse SPE) 样品前处理方法是一种快速、简便、安全、成本低廉的样品前处理分析方法，将该方法用于奶制品、鸡蛋和鱼肉等不同样本中的三聚氰胺的提取，主要步骤是使用0.1M的盐酸、6%的磺基水杨酸和混合型阴离子交换树脂（Cleanert PAX）在离心管中同时进行蛋白沉淀和基质分散固相萃取，取离心上清液过滤后用于HPLC测定。本文对MARS方法用于不同样品前处理的稳定性和可靠性进行了分析和评价，结果表明MARS-HPLC方法用于不同样品中三聚氰胺的检测具有简便、快捷、准确的优点，适合大批量样品的测定。 关键词：三聚氰胺；MARS；混合型阴离子交换树脂；强阳离子交换色谱柱 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 仪器：L6-1 系列高效液相色谱仪（北京普析通用公司），三聚氰胺检测样品前处理方法包：（包括盐酸0.1 mol/L，6% 磺基水杨酸，混合型阴离子交换填料Cleanert PAX，（北京艾杰尔科技有限公司）；Venusil SCX-M，5μm,4.6×250mm 强阳离子交换色谱柱（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技有限公司）及保护柱；针式过滤器（Agela Clarify，0.22/0.45μm，尼龙）；三聚氰胺标准品（>99%），均质器（T25 Basic，IKA）。 试剂：所用乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。 1.2 色谱条件 色谱柱：Venusil SCX-M色谱柱，4.6×250mm,5μm,300 ?；（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技有限公司）；流动相：磷酸二氢钾（0.050mol/L）：乙腈=70：30；流速：1.5mL/min；柱温：室温；波长：240 nm；实验中若非特别注明，进样量均为20μL。 1.3 三聚氰胺标准曲线工作液的配制 1.3.1 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。 称取100 mg 三聚氰胺标准物质（准确至0.1 mg），用水完全溶解后，用水定容至100 mL，混匀。 1.3.2 标准工作溶液 1.3. 2.1 标准溶液A：2.00 ×102 mg/L。 准确移取20.0 mL 三聚氰胺标准贮备溶液（1.3.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。 1.3. 2.2 标准溶液B：0.50 mg/L。 准确移取0.25 mL 标准溶液A（1.3.2.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
三聚氰胺的物理性质
三聚氰胺（英文名：Melamine），是一种三嗪类 分子立体模型 含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。 更多英文名称： 1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine； 2,4,6-Triamino-1,3,5-triazine；2,4,6-Triamino-s-triazine；Aero；Cyanuramide；Cyanuric triamide；Cyanurotriamide； Cyanurotriamine；DG 002 (amine)；Hicophor PR；Isomelamine；Melamine；NCI-C50715；Pluragard；Pluragard C 133；s-Triazine, 2,4,6-triamino-；Teoharn；Theoharn；Virset 656-4； 分子结构 化学式（分子式） C3H6N6 相对分子质量 126.15 CAS 登录号 108-78-1 EINECS 登录号 203-615-4 （左图为结构简式，右图为其球棍模型示意图） 物理性质 三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，不可燃，无味，低
分子模型 毒，密度1.573g/cm3 (16℃)。常压熔点354℃，急剧加热则分解；快速加热升华，升华温度300℃。在水中溶解度随温度升高而增大,在20℃时，约为3.3 g/L，即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。 化学性质 呈弱碱性（pH值=8），与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中（pH值5.5～6.5）与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。 合成工艺 三聚氰胺最早被李比希于1834年合成，早期合成使用双氰胺法：由电石（CaC2）制备氰胺化钙（CaCN2），氰胺化钙水解后二聚生成双氰胺（dicyandiamide），再加热分解制备三聚氰胺。目前因为电石的高成本，双氰胺法已被淘汰。与该法相比，尿素法成本低，目前较多采用。尿素以氨气为载体，硅胶为催化剂，在
蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法
蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子质量很大，大部分高达数百万，它们由20中氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中含微量的P、Cu、Fe、I等元素。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种蛋白质的含氮量也不同。 根据蛋白质的性质和成分，测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质的含量；另一种是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团等测定蛋白质含量。目前常用的有四种经典方法，即凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中考马斯亮蓝法（Bradford 法）法和Folin－酚试剂法（Lowry法）法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比双缩尿法（Biuret法）法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 一、常量凯氏定氮法 1.原理： （1）消化：样品与硫酸一起加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在酸性溶液中。 （2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。 为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。 （3）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。 （4）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。 2.操作步骤： 准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K 2SO 4 →加0.5gCuSO 4 →加 20ml H 2SO 4 →在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后， 将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在凯氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到凯氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。 3.计算： 总氮量%= （N(V 2-V 1 )×0.014）/W × 100 二、双缩脲法（Biuret法） 1.原理： 脲小心加热至150~160 摄氏度时，两个分子的脲脱去一个氨分子生成双缩尿，可于铜
游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)
八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样