聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过

氧化物酶同工酶

研究背景及目的

带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP )。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业分析中必不可少的手段。

同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

实验原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

系统的不连续性表现在以下几个方面：

（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。

下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：

（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一

定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：

①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：

V=I/S

所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。

当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。

过氧化物酶同工酶的鉴定原理

同工酶是来自同一生物不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构，能够催化相同反应的蛋白质。同工酶作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序（通过RNA）直接反应了DNA链上碱基对的顺序，其变化能代表DNA分子水平上的变化，所以同工酶分析可解释为是从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的有效手段。在生物中酶的表达直接受遗传基因的控制，酶经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。从小麦幼苗中提取的粗酶液电泳后，进行酶的特异染色，不同的酶组分显示在凝胶的不同位置而呈现生物特有的同工酶酶谱。

选取小麦为样品的原理

同工酶是基因的直接产物，具有明显的种属、组织和发育阶段特异性。ＰＯＤ同工酶是植物体中常见的氧化酶，它与超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶相互协调配合，清除过剩的自由基，使植物体内的自由基维持在一个动态的正常水平，以提高植物的抗逆性。

小麦在生长发育的后期．植株趋于衰老．子粒成熟，体内自由基及其衍生物的含量不断增加．尤其是SOD氧化自由基的产物过氧化氢的增加需要大量的POD来分解过氧化氢：另一